不同产地大枣中18种氨基酸含量测定及比较

2019-03-21李昊月张美慧李瑞海

亚太传统医药 2019年2期

李昊月，张美慧，李瑞海*

(1．沈阳市红十字会医院，辽宁沈阳 110013；2．辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600)

大枣在中国古代方剂中的应用很多，如《伤寒论》中使用大枣的方剂有40多首，枣的活性成分成为大家关注的热点。研究发现，大枣主要含有环磷酸腺苷(cAMP)、红枣低聚糖、无刺枣苄苷Ⅱ和芦丁等成分。祖国医学认为大枣味甘，性温，归脾、胃、心经，具有补中益气、养血安神的功效，可用于脾虚食少、乏力便溏、妇人脏躁的治疗。氨基酸也是大枣的主要有效成分，具有很强的生物活性。笔者实验室曾尝试采用柱前衍生化高效液相色谱法对一些中药材中氨基酸含量进行测定，积累了一些经验。本研究拟采用此法建立大枣中氨基酸的含量测定方法，并对不同产地大枣中18种氨基酸含量进行测定，以期为大枣的质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

氨基酸自动分析仪(P230II，大连依利特公司)；紫外检测器(UV230II，大连依利特公司)；电子分析天平(ALC-110.4，北京赛多利斯特仪器系统有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-4，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；高速粉碎仪器机(SF-130B，上海冠联制药装备有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070A型，上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药与材料

18种氨基酸对照品(中国食品药品检定研究院，20100108)，衍生化试剂(2,4-二硝基氟苯)(大连依利特公司)。固体组分A、固体组分B (大连依利特公司，20100212)。乙腈为色谱纯；冰醋酸、N,N-二甲基酰胺为分析纯；水为纯净水。大枣经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定符合药典要求。见表1。

表1 大枣的厂家、产地和批次

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1]

色谱柱：ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm，大连依利特)，柱温：27 ℃，检测波长：360 nm；流速：1.2 mL·min-1，梯度洗脱。具体程序见表2。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.2 流动相配制

A相∶乙腈-水(1∶1)；B相：固体组分B 4.1 g加水950 mL，冰醋酸调节pH=6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1 000mL量瓶中，摇匀后过滤，备用。

2.3 衍生缓冲溶液配制

取衍生缓冲溶液固体组分A 1.24 g，固体组分B 7.63 g，加水定容至500 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.4 平衡缓冲溶液配制

取平衡缓冲溶液固体组分A 0.91 g，固体组分B 3.58 g，加水定容至250 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.5 对照品溶液制备

精密称取氨基酸对照品适量(丙氨酸5.1 mg、组氨酸5.0 mg、脯氨酸4.9 mg、精氨酸5.3 mg、亮氨酸5.6 mg、丝氨酸4.8 mg、天门冬氨酸5.3 mg、异亮氨酸4.8 mg、苏氨酸5.0 mg、半胱氨酸5.0 mg、赖氨酸5.0 mg、色氨酸5.1 mg、谷氨酸5.0 mg、蛋氨酸4.9 mg、缬氨酸4.9 mg、甘氨酸4.9 mg、苯丙氨酸5.6 mg、酪氨酸2.7 mg)。加衍生缓冲溶液定容至25mL容量瓶中，精密吸取1mL，加衍生缓冲溶液定容至10mL容量瓶中，备用。

2.6 供试品溶液制备

取大枣样品粉末0.03 g，精密称定，置于具塞试管中，加3 mL 6 mol·L-1盐酸溶液[2]，混匀，置于烘箱110 ℃中水解24 h。水解后样品多次用水洗涤，从具塞试管转入蒸发皿中，80 ℃水浴加热蒸干。衍生缓冲溶液多次洗涤蒸发皿，转入25 mL容量瓶中，用衍生缓冲溶液定容，混匀，0.45 μm微孔滤膜过滤。取已过滤的样品液2 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入衍生化试剂1 mL ，放入60 ℃水浴中暗处反应1 h，取出冷却至室温，加平衡缓冲溶液定容至刻度，静置15 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.7 标准曲线绘制

取“2.5”项下25 mL容量瓶中对照品溶液0.01、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，分别加入衍生化试剂0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按照“2.6”项下方法制备。按照“2.1”项下色谱条件进样测定，进样量为20 μL，以各个氨基酸对照品溶液的进样量为横坐标X(μg)，相对应的峰面积值为纵坐标Y，绘制标准曲线。各个氨基酸的回归方程及线性范围见表3。

表3 各氨基酸成分的回归方程及线性范围

2.8 方法学考察

2.8.1 精密度试验取对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，连续进样6次测定，18种氨基酸各峰面积的RSD在0.57%～1.15%之间，表明精密度良好。

2.8.2 重现性试验取6份样品适量(过40目筛，每份约30 mg)，精密称定，按照“2.6”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，18种氨基酸含量的RSD在0.50%～1.29%之间，表明此方法具有良好的重现性。

2.8.3 稳定性试验取山西供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别于2、4、8、10、12、24 h进样测定，18种氨基酸峰面积的RSD在0.35%～0.99%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8.4 加样回收率试验分别取已知氨基酸含量的山西样品6份粉末适量(过40目筛，每份约30 mg)，精密称定，并分别精密加入对照品溶液适量(从天冬氨酸至酪氨酸分别加入对照品3.146 0、0.981 0、4.108 0、0.826 0、5.696 0、0.644 0、2.637 0、2.376 0、1.310 0、0.189 0、0.277 0、1.371 0、2.719 0、1.687 0、0.930 0、0.399 0、1.527 0和0.766 0 mg)，按照“2.6”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，进样测定，18种氨基酸峰面积的RSD在0.82%～2.38%之间，符合相关要求。