线粒体相关microRNA 在非酒精性脂肪性肝病中的研究进展

马卓奇 敖娜 都健

中国医科大学附属第四医院内分泌代谢内科，沈阳 110032

非酒精性脂肪性肝病( NAFLD) 是指患者在没有大量摄入酒精、病毒感染或其他肝病的情况下，形成的慢性肝脏疾病，其病理类型包括单纯脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎( NASH) 、肝纤维化和肝硬化［1］。NAFLD 是在全球引起肝脏疾病的重要原因之一，估计其患病率在全球为24%［2］。在一些西方国家，NAFLD 在普通人群中的患病率约为20%，NASH 的患病率约1.2% ～4.8%［3］。尽管NAFLD的预后相对较好，但仍有相当一部分患者会发展成为NASH和晚期肝硬化，且有可能进一步发展成为肝细胞癌。许多研究表明，线粒体功能障碍在NAFLD的发病中起重要作用，而近年来，越来越多的研究表明，microRNA( miRNA) 与肝脏疾病及线粒体功能障碍的发生关系密切，但其参与NAFLD发病的具体机制仍不明确。因此，阐明线粒体相关miRNA 对NAFLD 发生、发展的作用，对NAFLD的预防、早期诊断和治疗具有重大意义。本文就线粒体相关miRNA参与NAFLD 发生、发展的机制进行概述，以期为NAFLD 发病机制的研究提供帮助。

1 线粒体相关miRNA概述

miRNA 是一种大小约19 ～25 个核苷酸的非编码小RNA，可通过靶向mRNA，抑制其翻译或促进其降解，从而在转录后水平调控基因表达、细胞增殖、分化、代谢、凋亡等多种生物功能。miRNA中有一类与线粒体关系密切( 线粒体相关miRNA) ，是近年来发现的细胞代谢的关键调控因子，可影响线粒体功能，包括线粒体动力学、活性氧簇的产生、能量代谢和电子传递链等，在线粒体代谢、线粒体形态学、线粒体DNA 损伤和线粒体介导的凋亡中发挥重要作用［4］。

2 线粒体相关miRNA 与NAFLD

虽然NAFLD 的发病机制尚不明确，但“二次打击”假说被较多人认可。“第一次打击”包括胰岛素抵抗引起的肝脏脂肪堆积; “第二次打击”为线粒体功能障碍、炎性细胞因子、脂质过氧化和氧化应激的相互作用，导致肝细胞损伤、炎性反应和纤维化。近年来该假说已被“多重打击”假说所取代。“多重打击”假说中胰岛素抵抗导致脂肪生成增加和摄取肝游离脂肪酸( FFAs) 增加，脂毒性使肝脏易于受到“多重打击”损伤，包括线粒体功能障碍、内质网应激、饮食因素、脂肪酸、铁超载、炎性反应激活、肠道菌群脂多糖的产生、脂肪因子表达改变等，从而导致NAFLD［5］。

在NAFLD 患者中发现存在miRNA表达的改变，证实了miRNA参与NAFLD的发病［1］。另外，由于传统的病理技术( 如组织活检) 需要从病灶获得组织，会对肝脏造成损伤，具有一定风险，而且所取的局部肝脏组织并不能反映肝脏及患者的整体情况，而miRNAs受细胞外囊泡( 如外泌体) 、miRNA结合蛋白( 如argonaute) 和高密度脂蛋白的保护，非常稳定，在血浆中不会降解，因此其有可能成为非侵入性NAFLD的诊断标志物。

近年研究发现，线粒体在NAFLD的发病和进展中起重要作用，NASH患者和使用可致NASH药物的患者中都存在线粒体异常［3］。肝线粒体通过调节β氧化、三羧酸循环、ATP 合成和释放活性氧簇来协调能量代谢。线粒体是活性氧簇产生和脂肪酸β 氧化的主要部位，其功能受损将导致肝脏胰岛素抵抗、脂肪变化及活性氧簇在NAFLD不同阶段的增加［6］。线粒体活性氧簇生成的增加不但损伤线粒体DNA，而且可以导致大量细胞因子的表达增加以及诱导氧化应激［4，7-8］。此外，活性氧簇生成的增加通过抑制电子传递链，导致ATP 水平下降，从而影响肝细胞能量代谢和功能，甚至导致肝细胞死亡，这都与NAFLD的发生、发展相关［6］。因此，推测线粒体相关miRNA 可能通过影响线粒体功能，从而参与NAFLD。有研究发现，在NAFLD小鼠肝脏组织中线粒体相关miRNA发生显著变化［9-10］。多个线粒体相关miRNA参与了肝脏疾病的发生、发展，在其中发挥不同功能。

3 线粒体相关miRNA 参与NAFLD 的机制

3．1 线粒体相关miRNA调控细胞因子 线粒体中活性氧簇生成增加导致大量细胞因子的表达增加，包括Fas 配体、肿瘤坏死因子( TNF) -α、转化生长因子-β 和白细胞介素( IL) -8等，它们在调节机体炎性反应、胰岛素抵抗、免疫和代谢等过程中起重要作用，且参与了NAFLD 的发病［7］。

Ji 等［10］研究发现，miRNA-141-3p 可以促进促炎细胞因子IL-6的表达，影响脂蛋白脂肪酶，诱导炎性反应，进一步在HepG2细胞和高脂饮食诱导的小鼠肝脏中发现，miRNA-141-3p通过靶向第10 号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白同源体，激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 通路，促进ATP 的产生，导致线粒体功能障碍。在动物模型上，miRNA-378也被证明可以通过直接结合腺苷-磷酸激活的蛋白激酶γ2调节亚基( PRKAG2) ，调控沉默信息调节因子( SIRT)1 活性和核因子-κB-TNF-α通路，产生大量促炎性细胞因子，进一步促进肝脏炎性反应和纤维化。另外，通过比较38 例NASH 患者肝脏样本与24 名正常样本发现，miRNA-378 表达在NASH 患者中存在差异［11］。

近年来有研究者认为肠-肝轴参与了NAFLD 的发病，肠-肝轴功能障碍( 细菌过度生长、肠道菌群失调、黏膜通透性改变) 可能促进细菌及其产物易位进入门静脉循环，通过肝细胞Toll样受体信号激活炎性反应，并从单纯脂肪变性发展为NASH［12］。已有研究证实，miRNA-144的减少通过靶向Toll 样受体2，促进TNF-α 和干扰素γ 的分泌，从而促进核因子κB介导的炎性反应，引起高脂饮食诱导的大鼠模型的NASH 病理进展。相反，过表达miRNA-146b可以直接抑制IL-1 受体相关激酶1 和肿瘤坏死因子受体相关因子6，从而改善大鼠的NASH 病理进展［13］。而在NAFLD 中TNF-α水平升高，通过抗TNF抗体治疗小鼠，可以逆转模型中作为ETC 酶的线粒体呼吸链( MRC) 复合物活性的损伤。这些研究都证明，线粒体相关miRNA可以通过调控细胞因子，引起线粒体功能障碍，参与NAFLD的发生、发展。

3．2 线粒体相关miRNA 影响脂肪酸氧化 肝脏是脂肪酸氧化的重要部位，而线粒体是脂肪酸和葡萄糖氧化和代谢的主要细胞器，线粒体功能障碍可能导致脂质积累增加。肝脏脂质的积累是由血浆FFAs、脂肪从头生成和膳食脂肪的摄入共同作用的结果，这种脂质积累导致肝脂肪变性，其特征是在肝细胞中甘油三酯作为脂滴积累［6］。肝FFAs 通过线粒体β 氧化为肝脏提供能量，当脂肪酸氧化不能利用过多的FFAs 时，过量FFAs 被酯化成甘油三酯，导致肝脏脂肪变性［14-15］。此外，线粒体活性或表达异常引起的脂质积累会增加脂质毒性代谢物，进而引起肝损伤［14］。

已有研究在细胞层面证实，miRNA-29a-3p通过靶向过氧化物酶体增殖物活化受体( PPAR) δ，对葡萄糖转运蛋白4 启动子进行转录调控，影响从脂肪酸氧化到糖酵解的代谢转换［16］。在动物层面上，在NASH 动物模型中也可观察到PPARδ表达下降，而miRNA-199 可通过靶向心脏和肝脏线粒体中的PPARδ，减少脂肪酸氧化，改变线粒体含量和增加心脏、肝细胞脂质沉积［17］。此外，在NASH小鼠肝脏中PPARα表达降低，miRNA-21是NASH和肝细胞癌患者血清及肝中上调最多的miRNA之一，其以PPARα为靶点直接参与NASH 发病［22］。敲除miRNA-21可以诱导PPARα的表达，有助于实验模型疾病的好转，而在临床研究中发现NAFLD患者肝脏、骨骼肌和血清中miRNA-21水平明显升高，同时伴有PPARα的减少［18］。PPARα的激活增加了过氧化物酶体、线粒体β 氧化酶和解耦联蛋白2 mRNA的表达，而解耦联蛋白2 在肝脏组织中表达，与线粒体功能相关。因此可以推测，线粒体相关miRNA可通过调控PPAR来影响脂肪酸氧化，引起线粒体的功能障碍，参与NAFLD 的发病。

定位于线粒体的SIRT3 是一种线粒体组蛋白去乙酰化酶，是线粒体脂肪酸氧化的重要调控因子，其通过抑制活性氧簇在细胞过程中发挥重要作用。有研究发现，miRNA-421 通过抑制SIRT3，进而影响SIRT3/FOXO3通路来诱导NAFLD小鼠肝脏线粒体功能障碍［9］。而miRNA-33则通过靶向SIRT6影响脂肪酸氧化，因此推测线粒体相关miRNA还可以通过调控SIRT，影响脂肪酸氧化，从而诱导NAFLD 的发生。

在动物模型上的研究表明，miRNA-378通过核呼吸因子1 调控脂肪酸氧化，提示miRNA-378可作为NAFLD的潜在治疗靶点，而核呼吸因子1 是核编码线粒体蛋白和线粒体生成的关键调控因子［15］。另外，在动物模型中敲除miRNA-378-3p会导致其线粒体脂肪酸代谢增强，胰岛素靶组织氧化能力提高，证实miRNA-378-3p在线粒体呼吸中具有关键作用。

3．3 线粒体相关miRNA与氧化应激相关 在细胞层面上的实验证明，miRNA-15b-5p通过抑制Bmpr1a信号通路，增强细胞凋亡、氧化应激和线粒体损伤［19］。另外，miRNA-98-5p 作为一种应激相关的miRNA，在多种细胞类型和疾病中对细胞的存活、凋亡和氧化应激起重要的调控作用。有研究发现，在细胞中过表达的miRNA-98-5p可以抑制活性氧簇的产生，抑制miRNA-98-5p则出现了相反的现象［20］。而活性氧簇的产生可以诱导氧化应激。Elhanati等［21］也证明在肝细胞癌中miRNA-122对SIRT6进行转录后调控，且共同调控脂肪酸β 氧化，miRNA-122作为肝脏中最丰富的miRNA，可以影响胆固醇和FFAs 代谢、丙肝病毒复制和肝细胞癌生长等过程。临床研究发现，NASH患者血清miRNA-122比健康人上调7．2 倍，比单纯脂肪变性患者上调3．1 倍［22］。在人体组织及动物层面的研究还发现，miRNA-122与线粒体诱导的凋亡、调节脂代谢、炎性反应和肝脏氧化应激有关［23-24］。这些研究都表明，miRNA 可以通过氧化应激来参与NALFD 发病过程，而线粒体是氧化应激的主要场所，因此推测这些线粒体相关miRNA 可能通过线粒体来参与NALFD。

3．4 线粒体相关miRNA 调控线粒体复合物 有研究表明，NASH 患者肝脏中存在线粒体DNA 损伤，多个线粒体DNA 编码的多肽蛋白表达降低，部分由线粒体DNA 编码的复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ( ATP 合成酶) 活性降低，复合物Ⅱ( 仅由核DNA 编码) 活性降低，而NASH患者中，这些复合物的活性比正常人降低30% ～50%［3］。而这些复合物活性下降导致活性氧簇的产生和ETC 活性降低，ETC 活性降低可进一步损伤线粒体呼吸功能。

Jagannathan 等［25］发现在ATP6 位点，miRNA-378靶向并结合线粒体转录组，而抑制ATP6( ATP 合酶F0 复合体的亚基) 会影响ATP 生成。另外，miRNA-181c也被证实可以靶向调控ETC 复合物Ⅳ和线粒体细胞色素C 氧化酶1 的线粒体基因组亚基［26］。miRNA-33a、miRNA-661、miRNA-4485 则 可以分别通过影响线粒体复合物Ⅰ亚单位NDUFA5、线粒体复合物Ⅲ、线粒体复合物Ⅰ的活性，引起线粒体功能障碍和肝损伤，因此推测线粒体相关miRNA可能通过调控线粒体复合物，引起线粒体功能障碍，从而参与NAFLD的发病过程。

3．5 其他特殊类型的miRNA mitomiRNA是一种可以在线粒体中定位的miRNA，一般能同时靶向调控多个线粒体相关基因的mRNA，影响三羧酸循环、脂代谢和氨基酸代谢等多种代谢途径［27］。Bandiera等［28］在HeLa细胞的线粒体RNA 中发现了13 个含量丰富的核编码mitomiRNA，通过对其中4 个靶点(miRNA-328、miRNA-494、miRNA-513和miRNA-638) 的分析发现，其均与线粒体稳态相关。mitomiRNA的线粒体定位受动态调控，应激事件的发生，如创伤性脑损伤，与mitomiRNA 的重新分布有关，表明mitomiRNA可能参与了线粒体功能的改变，并可能导致代谢性疾病患者出现线粒体功能障碍。

在NAFLD患者中，miRNA-34a随着病情加重而上升，而SIRT1 的表达降低［22］。抑制miRNA-34a 则可以通过靶向SIRT1和激活PPARα，从而激活AMP活化蛋白激酶通路，改善肝脂肪变性，此外，其还可影响肝X 受体等转录因子，进而调节体内能量平衡［1，29］。而miRNA-146则通过靶向肝脏线粒体载体蛋白，参与NASH 的发病，将miRNA-146b类似物靶向输入NAFLD小鼠模型的肝细胞，可以有效缓解小鼠肝脂肪变性［30］。虽然已证实多个mitomiRNA参与NAFLD 的发病，但目前其与NAFLD发生相关的研究很少，具体机制尚不清楚。

4 总结与展望

近年来NAFLD的发病率呈上升趋势，严重危害人类健康，但目前仍缺乏特效的治疗措施。线粒体相关miRNA对线粒体功能有很大影响，而线粒体功能障碍在NAFLD发病机制中起重要作用。在组织、细胞、动物和分子多个维度的研究发现，线粒体相关miRNA 对多条代谢通路有影响，对其进行调节可用于NAFLD的治疗，虽然还未应用于临床，但其有望成为NAFLD潜在的药物靶点。另外，由于miRNA 在血液中的稳定性，其有可能作为NAFLD诊断及预后的分子标志物。总之，阐明线粒体相关miRNA参与NAFLD的作用机制，不但有助于对该病分子机制的研究，而且能为其诊疗和预防提供新的方法和思路。