非编码RNA与肝纤维化相关性研究进展*

张泽凤， 李晖， 邓秀秀， 辜群利

成都中医药大学附属医院中心实验室(四川成都 610075)

各种慢性损伤因素[1-2]导致肝实质细胞、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)、kupffer细胞及其他炎性细胞等释放出复杂的刺激信号，包括损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)、转化生长因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)、血小板生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等[3-4]，上述细胞因子及活性物质激活肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)成为肌成纤维细胞，表达α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)，通过调控TGF-β1/Smad3等相应信号通路[5]，导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)基因表达增强，促降解基因表达下降，特别是Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen，CoⅠ)和Ⅲ型胶原(Type Ⅲ collagen，CoⅢ)增加[6]。细胞因子及相应的信号通路仅关系着ECM基因转录的启动，而不编码蛋白质的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)作用在ECM基因转录过程或翻译水平。越来越多证据表明，ncRNA在介导炎症反应和免疫应答中具有重要作用[7]，在肝纤维化进程中，ncRNA出现明显的表达异常，并随着病情的进展而发生变化，其中最具相关性的有微小RNA(microRNA，miRNA)、长链ncRNA(long noncoding RNA，lncRNA)，二者均属于调节性ncRNA[8]。本文即对miRNA 和lncRNA与肝纤维化的相关性进行综述。

1 miRNAs与肝纤维化的相关性

miRNA属于短链ncRNA，由19～24个核苷酸组成，通常由RNA 聚合酶Ⅱ转录，初始转录产物在Drosha酶和双链RNA结合蛋白的作用下形成约70nt、具有发卡结构的pre-miRNA，pre-miRNA在转运蛋白Exportin-5的介导下从细胞核转入胞质后被Dicer酶等剪切形成较短的双链miRNA中间体，其引导链(成熟miRNA)与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合而产生作用。

大量文献报道了肝纤维化微环境刺激产生的miRNA和正常肝脏之间miRNA表达谱的差异[9-10]，而miRNA表达失调进一步影响促纤维化及抑制纤维化基因表达，影响肝纤维化进展。Lakner等[10]在CCl4诱导小鼠肝纤维化模型中发现23个miRNA的表达发生改变，其中13种miRNA表达下调，10种表达上调；在静止和激活的大鼠HSCs上进行miR微阵列分析(microarray analysis)、测定差异表达的miRNA，显示miR-17-92簇(19a、19b、92a)的成员在活化的HSCs中显著下调；Noetel等[11]发现，抑制HSCs活化为肌成纤维细胞的miRNA减少；而 miR-19b、miR-29、miR-150、miR-194体外过表达，可抑制HSCs细胞迁移特性，并减少肌成纤维细胞标志物α-SMA和胶原蛋白产生[12-13]。miRNA表达谱差异表现为miR-214-5p、miR-221/222、miR-21、miR-9、miR-125、miR-199a、miR-128、miR-17-5p等表达上调，miR-19b、miR-30、miR-193、miR-200a、miR-126、miR-122、miR-29、miR-34a、miR-133、miR-17、miR-378等表达下调。此外miRNA靶标包括组蛋白、甲基化酶及组蛋白去乙酰化酶等，故也可通过调控组蛋白修饰引起染色质重塑调节ECM基因的表达、导致基因转录阻遏或激活[14]。

1.1 具有抗肝纤维化作用的miRNAs 肝纤维化患者或动物、细胞模型，均可出现某些miRNAs的表达水平下调，而模拟物可起到抗纤维化的作用，目前研究较多的具有抗肝纤维化作用的miRNAs有miR-30、miR-193、miR-200a、miR-19b、miR-29、miR-101、miR-378a-3p等。由于其在HSCs活化和细胞外基质产生中的作用，TGF-β被认为是最重要的促纤维化细胞因子[15]；miRNA可通过抑制TGF-β信号通路，起到抗肝纤维化的作用。

在CCl4诱导的肝纤维化的小鼠模型，miR-30可抑制其直接靶标Kruppel样因子11(Krüppel-like factor 11，KLF11)的表达，减弱KLF11对Smad7转录抑制，从而增强对TGF-β信号传导起抑制性作用的Smad7负反馈作用，促进活化的HSCs逆转至静止状态[16]；无论是实验性肝纤维化还是肝纤维化患者，miR30、miR-193均出现下调，miR30、miR-193在肝纤维化中的潜在靶基因是TGF-β2，可通过调控TGF-β2 的表达水平减轻肝纤维化[17]；miR-200a[18]的过表达显著抑制了α-SMA的活性，影响依赖TGF-β1的HSCs的活化、增殖。

在CCl4诱导大鼠肝纤维化模型、肝纤维化患者[10]、胆道闭锁动物模型[19]及患者[20]，肝脏的miR-19b水平均显著降低，miR 19b模拟物可降低TGF-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)和SMAD3的表达，减少Ⅰ型胶原α1 及 α2 mRNA的表达，抑制HSCs活化，减少TGF-β和α-SMA的表达。

CCl4小鼠肝纤维化模型、胆管结扎小鼠模型及进展性肝纤维化患者，均出现肝脏miR-29家族表达水平的明显下调，HSCs中miR-29表达水平的下调是通过TGF-β和核因子-κB(NF-κB)依赖途径进行的，HSCs中miR-29的过度表达可下调胶原表达水平，阻止TGF-β1刺激的HSCs产生胶原，起到抗肝纤维化的作用[21]。miR-29b除通过抑制TGF-β2-Smad信号通路调控HSCs活化外，还可以抑制PI3K/AKT信号通路，诱导HSCs凋亡，抑制HSCs活化，减少α-SMA，阻止肝纤维化发生[22]；用携带miR-29b1类似物的纳米粒子治疗小鼠，可显著降低肝脏胶原沉积，改善肝脏损伤，促进肝纤维化恢复[23]。人丙型肝炎病毒(HCV)感染可下调肝细胞中miR-29水平，HSCs中的miR-29水平下降使胶原合成增加[24]。

miR-101是TGF-β信号通路的抑制剂，Tu等[25]在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型观察到活化的HSCs和受损肝细胞中miR-101显著下调，进一步实验验证了TGF-βⅠ型受体(TGFβ receptor Ⅰ, TβRⅠ)是miR-101的靶标，故可认为miR-101通过减少TGF-β RⅠ表达抑制TGF-β信号转导，促进活化的HSCs逆转为静止状态，抑制纤维化发展。

Hh(Hedgehog)信号途径促进肝纤维化并调节癌症有利的微环境，胶质母细胞瘤家族成员(Glioblastoma,Gli)Gli3和Gli2是Hh信号的转录激活因子。miR-378家族成员(miR-378a-3p，miR-378b和miR-378d)的表达在CCl4诱导小鼠纤维化模型中下降，其中miR-378a-3p通过靶向作用于gli3抑制HSCs的活化[26]。

1.2 具有促肝纤维化的miRNAs 肝纤维化患者或动物、细胞模型，均可出现某些miRNA的表达水平上调，而抑制剂可起到抗纤维化的作用，目前研究较多的具有促肝纤维化作用的miRNA有miR-34a、miR-126、miR-214。二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型中，miR-34家族表达水平上调[27]。过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptors α, PPAR-γ)是miR-34a和miR-34c的靶标，miR-34a和miR-34c的抑制剂可上调PPAR-γ表达水平，下调α-SMA，抑制肝纤维化[28]。

研究发现，miR-126的潜在靶标是核因子κB抑制子α (nuclear factor kappa B inhibitor alpha，IκBα)，过度表达的miR-126可抑制LX-2细胞中IκBα的表达，增加NF-κB表达，促进TGF-β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达[29]。

无论是活化的大鼠原代HSCs、LX2细胞株，还是CCl4诱导大鼠肝纤维化模型、NASH大鼠模型，miR-214均出现明显的上调，miR-214可能通过抑制Hedgehog信号通路负调节因子的表达，促进HSCs活化，达到促肝纤维化的作用[30]；miR-214还可通过调控表皮生长受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和TGF-β信号通路参与肝纤维化的形成[31]。但也有研究结果提示miR-214具有抗肝纤维化的作用，硫代乙酰胺诱导大鼠肝硬化模型中[32]，肝组织miR-214表达水平也出现上调，且与肝硬化进展程度平行，过度表达miR-214可减少α-SMA的表达，诱导活化HSCs凋亡，抑制成肌纤维细胞分化，具有抗肝纤维化的作用，因此miR-214的作用尚需进一步证实。

1.3 通过影响脂质代谢，调控肝纤维化的miRNAs 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、酒精性脂肪性肝病(alcoholic fatty liver disease, ALD)导致肝纤维化的比例在逐年攀升，因此调控脂质代谢，也是防控肝纤维化的重要手段，对脂质代谢产生影响的miRNAs主要有miR-122、miR29、miR155、miR-34a等。

miR-122主要在肝细胞中表达，维持肝脏内环境稳态、分化，在胆固醇和脂肪酸代谢中也起着关键作用，靶向调控多个脂质代谢相关酶，如脂肪酸合酶，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutarylcoenzyme A reductase，HMGCR)、固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)等[33-34]，miR-122表达水平下调与肝脏疾病的发生密切相关，NAFLD大鼠模型以及非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)患者肝组织中miR-122的表达均出现下调，miR-122敲除小鼠出现三酰甘油合成增加、分泌减少，导致三酰甘油累积在肝脏，甚至进展至脂肪性肝炎、肝纤维化[35]；miR-122的反义寡核苷酸可降低血浆高胆固醇水平[36]。与严重脂肪变性患者相比，轻微脂肪变性患者肝组织中miR-122水平更低。

人miR-29家族主要由miR-29a、miR-29b、miR-29c组成，主要在肝细胞和HSCs上表达。既往报道miR-29在药物性、胆汁淤积小鼠纤维化模型及CHB患者肝纤维化中下调[8]，近年在脂质代谢中有进一步发现，在NASH动物模型，出现肝脏miR-29a和miR-29c 的下调，miR-29a通过增加脂蛋白脂肪酶的表达，促进肝脏脂质沉着和脂肪性肝病发生；但也有研究得出不一样的结论， Kurtz等[37]在标准饮食处理小鼠体内，应用锁核酸29抑制剂，使miR-29家族功能丧失，导致血浆胆固醇水平降低约40%、肝脏中的脂肪酸含量约20%，在肝脏全转录组测序显示通过抑制miR-29而上调的基因中有抗脂质脱乙酰酶——沉默调节蛋白1(sirtuin 1, Sirt1)，和抗脂质转录因子——芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor, Ahr)，实验结论不一致可能与应用动物模型及实验条件的差异有关；体外证实，miR-29的抑制显著降低了从头胆固醇和脂肪酸合成。

miR-155在肝细胞和免疫细胞表达，NAFLD患者肝脏和外周血miR-155下调，miR-155的靶标是肝脏X受体α(liver X receptor alpha, LXRα)和PPARα，缺乏miR-155小鼠在高脂饮食6个月后，脂肪性肝炎形成的比例明显增加；miR-155过表达降低肝脏和血清脂质水平，减少高脂饮食导致的脂肪性肝炎形成[38]；但也有研究发现，高脂饮食喂养小鼠miR-155表达水平升高，miR-155基因敲除小鼠在应用甲基蛋氨酸胆碱缺乏饮食喂养5周，出现脂肪性炎症和肝纤维化减轻[39]，研究结论相互矛盾，需要进一步证实；miR-155基因敲除小鼠可缓解酒精诱导的脂肪性肝炎，酒精诱导的脂质沉着减少与过氧化物酶体增殖激活受体反应元素(peroxisome proliferator-activated receptors response element, PPRE)和PPARα增加有关。

miR-34家族由miR-34a、miR-34b、miR-34c组成，miR-34a在NALD和NASH中起重要作用，靶标为调控极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein, VLDL)代谢、脂肪酸β氧化、胆固醇合成等过程中关键性的转录因子，包括肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)、过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptors α, PPARα)、Sirt1和p53，NAFLD和NASH患者血清和肝组织miR-34a均升高，而且与VLDL、胆固醇、三酰甘油呈正相关， miR-34a上调可通过抑制Sirt1，AMP激活蛋白激活失活，维持HMGCR持续激活，从而增加肝脏胆固醇合成，使血清三酰甘油降低，肝脏三酰甘油增高；miR-34a通过抑制PPARα，抑制线粒体脂肪酸β氧化，导致脂质在肝脏的累积，肝脏中三酰甘油含量增加，鼠尾草酸可通过降低miR34a，激活Sirt1，起到治疗NAFLD的作用[40]。研究发现miR-34a在脂肪肝模型小鼠中显著上调，miR-34a模拟物转染HepG2细胞使miR-34a过表达，减少线粒体含量并增加脂质沉积，而miR-34a抑制剂可保护线粒体膜[41]。

2 lncRNAs与肝纤维化的相关性

lncRNA指>200nt的ncRNA，来源尚不清楚，大部分由RNA polymerase Ⅱ转录，少部分由RNA polymerase Ⅲ转录；最先发现并数量多的为长链基因间非编码RNA(long intergenic noncoding RNA，lincRNA)，根据在基因组上相对于编码基因位置，lncRNA可分为正义(sense)、反义(antisense)、双向(bidirectional)、基因内(intronic)、基因间(intergenic)[42]。lncRNAs功能可作为信号[43]、诱饵、引导或支架在转录水平上调节基因表达[25，44]。lncRNAs与肝纤维化的相关性表现在促肝纤维化作用或抗肝纤维化作用。

2.1 具有抗肝纤维化作用的lncRNAs

2.1.1 母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3) MEG3，也称为基因陷阱基因座2(gene trap locus 2，GTL2)，是一个母系表达的印迹基因，位于人14号染色体q32.3的Dlk1-Gt12印迹基因座[45]。在许多正常组织中表达，其编码与几种人类癌症相关的lncRNA。MEG3表达在多种肿瘤中减少或消失，如肝癌、胃癌、胶质瘤及宫颈癌等[46]。MEG3可诱导p53蛋白的积累，选择性调节p53靶基因表达，导致细胞生长抑制。研究发现[46]，MEG3水平在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型和TGF-β1诱导的LX-2细胞中显著降低，LX-2细胞中MEG3的过度表达可抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖，促进细胞凋亡。可能为MEG3的过度表达诱导p53的活化并介导cyt-c释放，导致TGF-β处理的LX-2细胞凋亡，作用机制可能与由p53依赖线粒体介导的凋亡途径有关； 但也有研究得出不一样的结论，Zhang等[47]发现肝纤维化和NASH导致的肝硬化患者，肝组织MEG3出现显著升高，因此，尚需更深入的研究进行证实。

2.1.2 生长抑制特异转录本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5) GAS5最初使用减影杂交从小鼠NIH 3T3细胞中分离，作为控制细胞增殖和生长的关键介质，GAS5与胃癌、前列腺癌等肿瘤相关[48]。GAS5在大鼠、小鼠肝纤维化模型和肝纤维化患者肝脏中的表达水平均显著降低，GAS5过表达抑制HSCs的活化，降低模型动物体内胶原的沉积；GAS5是miR-222的靶标，能够直接与miR-222结合，此外，作为miR-222内源性竞争性RNA，GAS5可通过增加p27蛋白含量，抑制HSCs活化和增殖[49]。

2.2 具有促肝纤维化作用的lncRNAs

2.2.1 肺腺癌相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1) MALAT1位于人染色体11q13.1(小鼠染色体19qA)内，在肿瘤细胞增殖，迁移和侵袭中起关键作用[50]；首次在非小细胞肺癌转移研究中被发现[51]。CCl4诱导小鼠肝纤维化模型中，肝组织MALAT1表达明显上调，活化HSCs中也出现MALAT1表达明显上调；MALAT1敲除后，抑制HSCs活化，小鼠肝脏胶原沉积降低，MALAT1表达与miR-101b呈负相关，MALATI和RAS相关C3型肉毒杆菌底物1(RAS-related C3 botulinum substrate 1, Rac1)是miR-101b的靶标[52]，Rac1是一种小G蛋白，属于Rho家族，可调节NADPH氧化酶活化的ROS主要细胞内生成物，Rac1的持续活化可维持HSCs活化表型表达并加剧肝损伤和纤维化[53]，MALAT1可通过作为竞争性内源RNA，增加Rac1表达，促进HSCs的增殖和活化[52]，加剧肝损伤和纤维化；MALAT1的表达在活化LX-2细胞中明显增高；MALAT1还能促进脂肪性肝炎[54]和胰岛素抵抗[55]，上述研究成果均提示MALAT1具有促肝纤维化作用。

2.2.2 Alu介导的p21转录调节因子(Alu-mediated p21 transcriptional regulator，APTR) APTR是7号染色体q21(chromosome 7q21)中的PTPN12和RSBN1L之间的基因间区域的相对链表达的2303个核苷酸的lncRNA[56]。P21，也是一种CDK抑制剂，与G1/S转换中重要的激酶如CDK4、CDK6、CDK2相关和抑制，其抑制e2F转录因子从而导致G1期细胞周期停滞。p21是抑制正常和癌细胞中的细胞增殖的关键分子，并且在多种水平上受到调节，在转录水平上DNA损伤时被激活最显著。研究表明，在纤维化肝脏和活化HSCs中APTR上调，用Ad-APTR siRNA处理的小鼠中观察到α-SMA和Col1A1表达的降低，在APTR敲除CCl4诱导小鼠肝纤维化的α-SMA蛋白上调， APTR可以募集多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)至p21启动子，从而抑制p21的表达，下调APTR通过增加p21抑制HSC的细胞周期和增殖[57]。此外，血清APTR水平可能反映肝硬化的严重程度，失代偿期肝硬化患者的血清APTR水平高于代偿期肝硬化患者[57]。

2.2.3 浆细胞瘤变型异位子1(plasmacytoma variant translocation 1, PVT1) PVT1在多种肿瘤中表达水平上调[58]，可介导肾脏系膜细胞ECM沉积[59]；Zheng等[60]报道，纤维化肝组织和活化HSCs中，PVT1均出现上调，去除PVT1减少胶原在模型动物肝脏的沉积，PVT1下调可通过抑制内皮-间质转化过程(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和Hh信号通路，使HSCs增殖、α-SMA和Ⅰ型胶原产生减少，从而抑制HSCs的活化；PVT1可通过竞争性地与miR-152结合来下调Patched 1，一种Hh信号通路的负向调节因子，激活HSCs，进而促进EMT过程的发生，促进肝纤维化。

2.2.4 同源盒转录反义RNA(homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR) HOTAIR位于12号染色体上的同源框C(homeobox C，HOXC)基因座中，在多种肿瘤中高度表达并涉及肿瘤的不良预后，如乳腺癌、胰腺癌、结肠癌及非小细胞肺癌等；此外，HOTAIR在肝癌中具有异常表达，并且与肝癌的进展和复发密切相关。

HOTAIR在CCl4诱导小鼠肝纤维化模型、HBV感染后肝纤维化患者以及活化的HSCs中及均显著升高，LX-2细胞中增加HOTAIR的表达可促进细胞增殖和活化；上述作用可能通过调控HSCs的DNA甲基转移酶(DNA metheyltransferase 1, DNMT1)、MEG3和p53通路实现[61]。Yu等[62]研究证明HOTAIR上调与肝纤维化的进展相关，在CCl4诱导肝纤维化小鼠中HOTAIR表达增加，抑制小鼠体内的HOTAIR表达水平，Ⅰ型胶原和α-SMA水平显著减弱，HSCs增殖和细胞周期也受到抑制；HOTAIR过表达可通过下调miR-29b表达并减弱其介导的表观遗传机制，导致DNMT3b和PTEN甲基化增强，部分地促进HSCs活化。

2.2.5 核旁装配转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1) NEAT1由多发性内分泌肿瘤基因座转录形成的一种新型lncRNA，是参与组成旁斑亚细胞器的核心结构组分，作为许多基因的转录调节因子，也在各种肿瘤的细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌等[63]。Zhang等[64]发现在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型和分离活化的HSCs中NEAT1表达显著增加，NEAT1的过表达加速HSCs活化，包括HSCs细胞增殖和胶原蛋白表达，而NEAT1缺失在体内和体外均可抑制肝纤维化；NEAT1和Kruppel样因子6(Kruppel-like factor 6, KLF6)都是miR-122的靶标，且NEAT1对HSCs活化的可被miR-122模拟物或KLF6敲除所阻断，证明NEAT1竞争性结合miR-122通过miR-122-KLF6轴参与了HSCs活化。Wang等[65]发现在NAFLD大鼠模型中，NEAT1表达水平和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS) mRNA水平均明显增强，敲除NEAT1可降低肝细胞中FFA诱导的ACC和FAS升高，延缓NAFLD大鼠模型中的NAFLD进展。

2.2.6 肝纤维化相关lncRNA1(liver fibrosis-associated lncRNA1, lnc-LFAR1) Lnc-LFAR1促进肝纤维化，沉默lnc-LFAR1可抑制HSCs活化，减少TGF-β诱导的肝细胞凋亡，该作用在CCl4诱导和胆管结扎小鼠肝纤维化模型中均得到证实；Lnc-LFAR1促进Smad2/3与TGF-βR1的结合，也可直接与Smad2/3结合，促进TGF-β、Smad2、Smad3、Notch2和Notch3等的转录，激活TGF-β和Notch信号通路，促进肝纤维化[64]。

3 总结

近年，ncRNA在肿瘤诊断治疗中迅速发展，且越来越多证据表明ncRNA在调节炎症及免疫中也具有重要作用，随着人工ncRNA抗原性的解决、靶标预测工具的开发、运输递呈载体的深入研究，使ncRNA在临床运用中具有可实现性；肝纤维化形成机制涉及多种细胞因子及信号途径形成的复杂网络，单一细胞因子或信号途径靶点控制难以调节炎性反应/炎症抑制、免疫应答/免疫损伤、损伤修复/胶原过度沉积、诱导凋亡/细胞损伤等多方面失衡，调节肝纤维化相关ncRNA表达水平，可望是解决肝纤维化治疗矛盾的有效方法。