糖尿病胃轻瘫动物模型在针灸基础研究中的应用*

智沐君 陈立园 袁 月 王富春 刘晓娜

近年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病(diabetes mellitus, DM)成为世界上第三大非传染性疾病[1]，发病率逐年上升[2]。糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis, DGP)是DM众多并发症之一[3]，主要表现为胃动力障碍、胃排空延迟等一系列综合症状[4]，有近30%～50%的DM患者出现胃排空障碍症状[5]。因此，DGP的发病机理及治疗方法的研究备受世人的关注，而选择合理的DGP动物模型是研究DGP的基础，至关重要。现代研究证明针灸能够改善胃运动，减轻DGP的临床症状[6]，美国胃肠病学杂志发布的胃轻瘫临床管理指南中多次提到针灸的有效性。现有多种方法和途径建立DGP动物模型，本文对其做以下的综述，并探讨其在针灸治疗DGP的机制研究的应用。

1 针灸对DGP研究的主要方向

针灸是治疗糖尿病胃轻瘫的一种有效的治疗手段，因其具有多靶点、非特异性等特点，其治疗机制研究尚需深入。

1.1 降糖张卉等[7]观察了壮医线点灸的方法对糖尿病胃轻瘫大鼠胃肠推进率和血糖的影响，采用的是一次性链脲佐菌素腹腔注射配合高脂高糖饲料及不规则饮食法制备的糖尿病胃轻瘫模型，治疗后大鼠的血糖明显降低，且胃肠推进率得到了有效的提高。

1.2 修复平滑肌陈小丽等[8]观察到针刺能够促进胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK等蛋白表达，从而增强了磷酸化肌球蛋白轻链的水平，从而起到改善糖尿病胃轻瘫症状的作用。采用的是链脲佐菌素腹腔注射配合8周的普通喂养形成的DGP模型。

1.3 胃肠激素研究显示针刺能够调节多种胃肠激素状态。李秀红等[9]观察了电针对糖尿病胃轻瘫大鼠胃动素(MOT)及生长抑素(SS)的影响，采用的是DM模型成模后采用高脂高糖饲料自由进食喂养10周确认成DGP模型，结果显示电针能够改善糖尿病胃轻瘫大鼠高胃动素和高生长抑素的状态。

1.4 调整胃电节律梅志刚等[10]观察了针药联合对糖尿病胃轻瘫动物的胃肠动力和胃肌电活动，采用的模型是链脲佐菌素配合高脂高糖饲料喂养形成的DGP模型。结果显示针药结合可以提高糖尿病胃轻瘫小鼠的胃肠动力，改善胃电节律，其作用机制可能是通过调整胃窦部ICC数量或改善其结构，使胃电节律恢复、胃肠蠕动功能提高。

2 DGP模型的选择

一个成功的DM模型是DGP模型成功的基础。常用的DM造模方法有链脲佐菌素(STZ)法、四氧嘧啶(ALX)法、注射葡萄糖法、高脂饮食法等。但单一的药物注射造模只能制作出DM模型，结合糖尿病胃轻瘫的成因，DGP模型多在DM模型的基础上配合饮食进行造模。

2.1 链脲佐菌素法配合饮食STZ能够选择性破坏胰岛β细胞，导致胰岛内胰岛素合成和分泌减少，从而引发DM[11]。小剂量多次注射可以造成2型糖尿病模型，大剂量单次注射可造成1型糖尿病模型。陈霞等[12]使用0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液配制的2% STZ一次性注射到SD大鼠腹腔内(60 mg/kg)。在造模后3 d开始测空腹血糖，血糖持续1周达到16.9 mmol/L判定为糖尿病模型造模成功，并在造模成功后10周进行胃肠动力检测，判定糖尿病胃轻瘫造模成功。柏晓辉等[13]使用小剂量STZ联合高能量饮食法进行DGP模型造模，在SD大鼠高能量饲料喂养4周后，腹腔注射0.1 mmol/L的枸橼酸缓冲液配制成的STZ溶液(20 mg/kg)；3 d后进行第2次注射，剂量为25 mg/kg；第2次注射后3 d进行第3次注射，剂量为35 mg/kg。在造模后测定血糖和胃内残留率作为检测成模指标，血糖界限为16.9 mmol/L。其中高能量饲料配方为碳水化合物61%，脂肪14%，蛋白质14%，蔗糖10%，胆固醇1%。万全荃等[14]使用单次55 mg/kg腹腔注射2%的STZ配合高脂饲料不规则喂养8周来建立DGP模型。不规则喂养采取高糖高脂饲料单日上午和双日下午进食。成模标准为血糖≥16.7 mmol/L，尿糖阳性，胃排空率和小肠推进率与对照组有明显差异。高脂饲料的比例为普通饲料58%，熟猪油15%，蔗糖20%，奶粉5%，鸡蛋2%。张琴等[15]使用1%STZ腹腔注射(50 mg/kg)结合饮食失节法进行糖尿病胃轻瘫模型造模，大鼠品种选择的是雄性Wistar大鼠。饮食失节法具体操作为喂养高热量饲料，采取单日上午进食和双日下午进食的原则，饲养周期为6周。高热量饲料的比例为碳水化合物51%，脂肪25%，蛋白质14%。判定成模方法为血糖监测和胃残留率检测。

2.2 四氧嘧啶(ALX)法配合饮食使用四氧嘧啶对胰岛细胞进行化学损伤，是1型糖尿病动物模型常用方法之一，操作简单，成本低廉。ALX通过产生超氧自由基与富含-SH的胰岛β细胞特异性结合，使细胞内DNA损伤，并激活多聚ADP核糖体合成酶的活性，导致mRNA功能受损，β细胞合成前胰岛素减少，最终导致胰岛素缺乏[16]。吴国泰等[17]使用正交试验法优化了ALX法复制糖尿病胃轻瘫模型，最终推荐1个月的标准饲料喂养，注射ALX的剂量为250 mg/kg。张玉等[18]使用ALX联合饮食失节法成功诱导了家兔糖尿病胃轻瘫模型，其中ALX的浓度为10%，饮食失节法使用高糖高脂饲料不规律喂养2周。通过血糖和胃排空率来判定是否成模。高糖高脂饲料比例为常规饲料66.5%，猪油10%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸盐1%。孙泽庭[19]选用Wister大鼠进行ALX造模糖尿病模型，3 d后灌服熟地黄，浓度为200%，按照2 ml/100 g进行，持续进行2周。熟地黄是滋阴补血的一味中药，主要用于阴血不足等症，现代研究表明熟地黄能够明显抑制小鼠胃肠推进运动和家兔离体小肠平滑肌的自发活动[20]，同时大剂量的熟地黄有明显的升糖作用[21]。实验后通过观察大鼠的血糖稳定程度和MMCⅢ期运动减弱或消失来判定糖尿病胃轻瘫模型造模成功。秦明等[21]选择5%的四氧嘧啶水溶液以120 mg/ml给大鼠连续注射2 d，后以200%的熟地黄进行灌服，并在2周后判定为胃功能障碍模型。

2.3 自发性模型随着技术的发展，现已有多种自然条件下发生糖尿病的动物模型，其发病进程与人类更为相似，具有较高的应用价值。如瘦素基因纯合突变的ob/ob小鼠[23]、瘦素受体基因纯合突变的db/db小鼠[24]、新西兰肥胖小鼠(New Zwaland obses mice, NZO mice)[25]、M16小鼠[26]、ZDF大鼠[27]等，其均可以结合不规则饮食喂养建立糖尿病胃轻瘫模型。但自发性模型多价格昂贵，饲养费用及条件十分严格，动物的繁殖率低等，导致自发性模型并不作为基础研究的首要选择。

3 DGP模型评价指标

一个成功的动物模型建立需要有合适的评价指标作为例证。因此在基础研究中除了选择一个合适的动物载体外，还需要根据实验需求选择合适的评价指标。

3.1 血糖血糖作为最直接的指标，常用来判定是否成功建立糖尿病模型，常用的糖尿病模型判定使用的是血糖大于11.1 mmol/L。杨建文等[28]根据血糖大于等于16.7 mmol/L，判定DGP模型成功。

3.2 胃内残留率胃内残留率检测[29]前需禁食不禁水24 h，灌胃半固体糊状物2 ml/只，30 min后处死，取胃，称胃全重，随后沿胃大弯剖开，除去内容物后再次称重，以(胃全重-胃净重)/糊重×100%为胃内残留率。

3.3 胃排空率测定胃排空率测定前需禁食24 h，禁水2 h，操作前以50 mg/dl的酚红溶液2 ml灌胃20 min后立即处死，取出全胃并沿胃大弯切开，冲洗胃内容物，定容为20 ml，加入0.5 ml/L的NaOH 20 ml搅拌均匀后静置1 h，取5 ml上清液，加入三氯乙酸0.5 ml去蛋白后离心，取上清液用分光光度计测定560 nm的波长下的吸光度值(OD)。另制备2 ml酚红溶液，18 ml蒸馏水、0.5 mol/L NaOH 20 ml、三氯乙酸4 ml搅拌均匀，测定吸光度值。大鼠的胃排空率=(1-实测酚红吸光度/标准酚红吸光度)×100%。

3.4 小肠推进率测定小肠推进率测定常与胃排空测定同时使用，是在胃排空测定的同时取出小肠，并将其平铺于白纸上，测定幽门至回盲部全长及幽门至酚红所到距离，小肠推进率=酚红在小肠中的移行距离/小肠全长×100%。

3.5 墨汁灌胃法墨汁灌胃法[8]与小肠推进率原理相似，区别在灌胃物质为黑色墨水，比例为1 ml/100 g，灌胃20 min麻醉处死，取出幽门至回盲部的肠管，测量墨团距离及肠道全长。小肠推进率=墨水前端至幽门括约肌距离/幽门括约肌至小肠末端距离×100%。

3.6 MMCⅢ运动幅度检测MMCⅢ是指胃窦部在消化间期移行性复合运动Ⅲ期，糖尿病胃轻瘫患者除了早饱、胃排空延迟等症状外，一般都伴有餐后胃窦部MMCⅢ期收缩波的减弱或消失，因此可采用多媒体生理记录仪连接的应力传感器固定在大鼠的胃黏膜上，测定其胃的机械收缩运动波，并对MMCⅢ 运动幅度进行记录观察，从而判定是否形成DGP模型[19]。

3.7 胃排空闪烁扫描法胃排空闪烁扫描是利用SPECT/CT技术，对胃排空的各个时间点进行实时记录。在临床中胃排空闪烁扫描被称为胃排空评价的“金指标”[30]。

4 讨论

用动物模型复制人类疾病进行病因研究与改进疾病防治方法是医学发展的重要途径。任何一种模型制备方法均有一定局限性，有待在不断的探索中进一步深入与细化。现阶段建立DM动物模型的技术方法已较为成熟，但在DGP模型的建立上却各有各不同，主要是因为并未有一种标准化的判定标准对糖尿病胃轻瘫模型进行客观评价。现有最常用的判定标准是采用小肠推进率和胃肠排空，但在操作过程中需处死大鼠进行测量，在针灸基础研究中并不适用。因此我们需要寻找到一种可以不打断完整证据链的基础上的客观判定标准，在后续的研究中，我们将寻找一种在不伤害动物的前提下进行的一种胃排空测定，为糖尿病胃轻瘫动物模型的判定找寻一种新的方法。