辛伐他汀促进兔肩袖损伤修复术后腱-骨愈合的实验研究

李肯 于腾波 戚超 赵夏

青岛大学医学院附属医院运动医学科（青岛266000）

肩袖肌腱损伤是引起慢性肩痛和肩部功能障碍的常见原因之一，多与创伤和关节退行性变有关[1]。全层肩袖撕裂的发生率在肩关节病变中占5%～40%[2]，其中冈上肌损伤最为多见[3]，且常需要手术治疗，然而肩袖修复术后常涉及腱-骨愈合问题。多达95%的肩袖肌腱在修复后腱-骨愈合不良[4]。如何更好地促进肩袖腱-骨愈合，成为评价手术成败的关键。辛伐他汀属于羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂（hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor），是胆固醇合成途径的限速酶，不仅用来治疗高脂血症，还是研究成骨作用的热点药物之一[5]。研究证明，辛伐他汀可促进兔前交叉韧带重建腱-骨的早期愈合[6]，但目前缺乏其对肩袖腱-骨愈合作用的相关研究。本实验建立兔冈上肌损伤修复模型，通过组织学及生物力学方法来研究辛伐他汀对兔肩袖损伤修复术后腱-骨愈合的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

36 只成年雄性新西兰大耳白兔（体重2.5～3 kg，青岛大学动物实验中心提供），所有实验兔均在青岛大学清洁级动物房内饲养，实验过程对动物的处置符合医学伦理学标准。36只兔随机分为实验组、实验对照组及空白对照组，每组12只。

1.2 辛伐他汀/甲基纤维素凝胶的制备

取粘度为4000 mPa.s的甲基纤维素（上海迈瑞尔化学技术有限公司）4 g，将其溶解于100 ml沸三蒸水中，磁力搅拌器搅拌均匀后冷却至室温，配制成4%的甲基纤维素凝胶。取辛伐他汀（杭州默沙东制药有限公司）50 mg用无水乙醇10 ml溶解，配制成5 mg/ml的辛伐他汀乙醇溶液。取2 ml辛伐他汀乙醇溶液与甲基纤维素凝胶混合，使每毫升甲基纤维素凝胶中含有1 mg辛伐他汀，置于4°C冰箱保存备用[7，8]。

1.3 手术方式

饲养观察1周确认饮食活动正常，取所有兔的左肩关节作为手术侧，术前禁饮、禁食8小时。臀部注射16万单位青霉素预防感染，用10%水合氯醛（2.5 ml/kg）以2～3 ml/min行耳缘静脉缓慢推注，推注过程注意观察兔角膜反射和呼吸频率，麻醉成功后置于右侧卧位并固定于动物手术台，垫肩，牵出舌头，术区备皮、消毒、铺巾。沿兔冈上肌腱肱骨大结节附着点长轴做约2 cm纵行切口，逐层分离皮下组织及三角肌，暴露兔冈上肌，切断大结节止点上的冈上肌肌腱，用标尺测量标记笔标记0.5 cm×0.5 cm的区域，然后用刀片沿肱骨大结节至冈上肌肌腹方向剥离冈上肌造成大约0.5 cm×0.5 cm的缺口，造成兔全层肩袖损伤，用牙科磨钻将冈上肌腱-骨结合部分打磨一骨槽（8 mm长，2 mm宽，2 mm深），用直径为0.8 mm的克氏针自骨槽内侧向肱骨大结节外侧皮质钻两个骨孔，用5-0普理灵不可吸收缝线以水平褥式缝合法穿过骨孔将冈上肌肌腱断端拉回骨槽。在打结固定前，实验组在骨槽内注入0.5 ml辛伐他汀/甲基纤维素凝胶；实验对照组注入0.5 ml甲基纤维素凝胶；空白对照组不注入任何药物，逐层缝合切口。见图1。

术后常规饮食，庆大霉素（3 mg/kg）后腿肌注预防感染，持续 3天，术后单笼限制性饲养，无须制动固定。

图1 将辛伐他汀/甲基纤维素凝胶注射到大结节骨槽上并用5-0 Prolene缝线穿过骨孔以水平褥式缝合法缝合

1.4 检测方法

1.4.1 标本采集

3 组于术后第2、4、8周各处死4只兔子，以冈上肌止点为中心，截除近端的肩胛骨和远端肱骨，仅保留冈上肌腱与近端肱骨，剔除其余软组织，用浸过生理盐水的湿纱布包裹后行生物力学测试，测试完毕后，将标本放入10%的中性福尔马林溶液中，4℃冰箱保存。

1.4.2 生物力学测试

将标本固定在美国产Instron-3300万能材料试验机（青岛大学提供）上进行拉伸试验，每个标本先以5 N的拉力预处理1分钟，然后以载荷率为5 mm/min行拉断试验，测量最大载荷与刚度。见图2。

图2 样本安装在万能材料试验机上

1.4.3 组织学观察

将生物力学测试完的标本置于10%甲醛溶液固定24 h后EDTA脱钙，然后再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，沿腱-骨界面纵轴切片，制成4 μm厚的切片，术后2、4、8周进行甲苯胺蓝染色及血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化染色；术后4周行Masson染色。VEGF的检测根据VEGF免疫组化试剂盒说明书进行操作，观察VEGF的表达情况。

1.4.4 免疫组化评分标准

为了便于数值化腱-骨愈合界面VEGF的表达情况，我们采用Wilko等[9]的评分标准。在400倍高倍镜下每张切片随机取5个视野，按照染色强度及阳性细胞所占的比例进行评分。染色强度评分：0分（无染色）；1分（淡黄色）；2分（黄色）；3分（棕褐色或棕黄色）。阳性细胞所占比例评分：0分（无细胞着色）；1分（阳性细胞计数＜10%）；2分（阳性细胞计数10%～50%）；3分（阳性细胞计数51%～80%）和4分（阳性细胞计数＞80%）。两者相乘，得到一个免疫组化染色分值，范围0～12。

1.5 统计学处理

采用SPSS16.0统计软件处理，所有计量数据均以均数±标准差表示，同一时间不同组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用方差分析。P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 生物力学检测

随着术后时间的延长，三组腱-骨界面的最大载荷和刚度均逐渐增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；术后2周，实验组腱-骨界面的最大载荷和刚度与实验对照组及空白对照组比较无差异（P＞0.05）；术后4、8周，实验组腱-骨界面的最大载荷和刚度高于其余两组（P＜0.05）。实验对照组与空白对照组比较无差异（P＞0.05）。见表1、表2。

表1 术后各时间段三组腱-骨界面最大载荷结果（N，n=4）

表2 术后各时间段三组腱-骨界面刚度结果（N/mm，n=4）

2.2 甲苯胺蓝染色

2 周实验侧腱-骨界面处可见较多成纤维细胞及少量软骨细胞，其余两组见部分成纤维细胞增生，肌腱与骨结合较为松散，4周实验侧可见大量串状排列的软骨细胞，肌腱与骨结合较为致密，其余两组新生软骨细胞较少，8周实验侧可见成熟的软骨细胞和新生的骨细胞，以及类似“潮线”结构，其余两组有部分新生骨细胞及软骨细胞，但肌腱与骨结合不如实验组致密。

图3 甲苯胺蓝染色（×100）

2.3 免疫组化

在高倍镜下的各周切片中，三组腱-骨界面均可见VEGF阳性细胞表达。术后2周，实验组VEGF阳性细胞表达明显高于其余两组；术后4周及8周，实验组腱-骨界面的VEGF表达趋于下降，但仍多于其余两组。见图4。

术后2周，实验组腱-骨界面的VEGF表达明显高于其余两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后4周及8周，实验组腱-骨界面的VEGF表达与其余两组比较无差异（P＞0.05）。见表3。

表3 术后各时间段三组腱-骨界面VEGF评分结果

图4 VEGF免疫组化染色（×400）

2.4 Masson染色

4 周实验侧腱-骨界面见较多弥漫增生的胶原纤维，粗细均匀且排列整齐，但肌腱与骨结合较为松散。其余两组胶原纤维无明显增生。见图5。

图5 Massn染色（×100）

3 讨论

肩袖在维持肩关节的稳定性中具有十分重要的作用。肩袖损伤常需要手术治疗，术后再次撕裂的情况十分常见，这与损伤部位血供薄弱、肌腱萎缩变性、脂肪浸润以及张力较高无法做到无张力修补等有关[10]。有研究表明，较为理想的腱-骨愈合方式为直接愈合[11]。而肩袖修复术后多以瘢痕黏连为主，较难形成直接止点。所以，恢复腱-骨界面的直接止点结构就变得尤为重要。

近些年来，国内外研究发现骨形态发生蛋白（BMPs）、富血小板血浆（PRP）、自体骨膜移植、体外冲击波治疗以及干细胞技术具有促进腱-骨愈合的作用[12-16]。辛伐他汀作为他汀类药物的一种，是常用的一种降脂药，可以上调骨骼肌蛋白、骨钙素和I型胶原蛋白等细胞外基质蛋白的表达，加速新骨形成[17，18]。有研究表明，将他汀类药物应用到大鼠股骨骨折模型中可以改善骨折愈合[19]。Maciel-Oliveira等研究发现，辛伐他汀具有双重作用，不但可以增强成骨细胞活性来刺激骨组织的再生，而且可以抑制破骨细胞的活性[20，21]，这可能与破骨细胞前体融合及其肌动蛋白环遭到破坏有关[22]。此外，辛伐他汀可通过诱导骨形成蛋白-2（BMP-2）以及碱性磷酸酶来增强骨形成，其中BMP-2起决定性作用[23]。辛伐他汀能增强BMP-2启动因子的活性来增强BMP-2在成骨细胞中的表达。BMP-2属于TGF-β 1超家族的一员，是已知的具有最强骨诱导能力的生长因子，能增强成骨细胞分化，诱导骨组织形成[24-26]。

我们分别从甲苯胺蓝染色、VEGF免疫组化分析、Masson染色以及生物力学检测四个方面进行讨论。在甲苯胺蓝染色方面，有研究表明，成纤维细胞（FB）是最为重要的修复细胞，其促进腱-骨愈合的生物学功能是双向的。它既能以自分泌或旁分泌的形式分泌多种生长因子如VEGF、PDGF、TGF-β等，同时又受多种生长因子的调控，刺激内皮细胞增殖及胶原合成，从而加速组织愈合与修复[27]。本次研究结果显示：实验组2周腱-骨界面出现了比较多的成纤维细胞且与其余两组相比明显增多，提示辛伐他汀能够促进肩袖修复术后成纤维细胞的增殖，进而上调生长因子的表达来促进腱-骨愈合。实验组4周见大量串状排列的软骨细胞；8周见新生的骨细胞以及“潮线”结构，提示辛伐他汀能够有效地促进软骨细胞的生成并诱导软骨细胞向成骨细胞分化，加快腱-骨界面“直接止点”的形成。在免疫组化方面，血管内皮生长因子（VEGF）亦称作血管通透因子，是目前促进血管生成的最强有力的生长因子之一。VEGF能够与血管内皮细胞表面受体特异性结合，加速新生毛细血管及肉芽组织的形成。同时，还能增加血管通透性、促进肌腱本身的塑形改造等[28，29]。有研究表明，血管的生成在腱-骨愈合中起着比成骨作用更重要的作用，因为新生血管的再生意味着肌腱周围的骨再生[30]。Maeda等证明辛伐他汀能够增强VEGF的表达来促进血管生成及成骨细胞分化，并在第2周促进骨向内生长进入腱骨界面，对腱-骨愈合具有积极作用[31，32]。然而 VEGF 的表达具有时限性，徐红立[29]等研究发现，腱-骨界面VEGF的表达在术后7～10天左右达到高峰，之后逐渐趋于下降。也有研究表明VEGF在ACL重建术后14天左右高度表达[33]。本研究结果显示：实验组术后2周腱-骨界面VEGF的表达明显高于其余两组，而随着时间的延长，实验组VEGF阳性细胞逐渐减少，与其余两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。提示辛伐他汀主要在肩袖修复的早期发挥作用，通过上调腱-骨界面VEGF的表达水平，来促进血管内皮细胞增生，从而加速新生血管的生成，对腱-骨愈合具有重要意义。在生物力学方面，术后2周实验组与其余两组的最大载荷及刚度相差较小（P＞0.05）。我们推测，这可能与腱-骨愈合在术后14天内以瘢痕增生为主有关，而瘢痕增生主要与TGF-β1的表达有关。TGF-β1是一类调节细胞生长和分化的超家族细胞因子，在瘢痕的产生过程中起到关键作用，主要通过Smad通路调控细胞外基质的代谢，促进瘢痕愈合[34]。Kawamura等研究表明[35]，TGF-β1在腱-骨界面的高度表达会一直持续到术后3～4周。本研究结果显示：术后4周及8周实验组腱-骨界面的抗拉强度均明显大于其余两组（P＜0.05），提示实验组腱-骨界面的愈合已趋向纤维软骨性增生，而非瘢痕愈合，这与Kawamura等的结果大致吻合。表明辛伐他汀能在中期促进腱-骨界面纤维软骨性增生，从而增强腱-骨界面的抗拉强度及刚度，对腱-骨愈合具有积极作用。Masson染色结果显示：实验组4周腱-骨界面胶原纤维的走形及生成情况优于其余两组，表明辛伐他汀可以促进腱-骨界面胶原纤维的生成，从而加速腱-骨愈合的进程。

关于辛伐他汀的用药剂量一直存在争议。本研究选用了0.5 mg的辛伐他汀。有研究证明0.5 mg辛伐他汀作为注射剂量对兔骨缺损模型的修复效果显著[36]。Stein等在进行辛伐他汀（0.1、0.5、1.0和2.2 mg）的剂量递增研究时发现：除了0.1 mg以外，其余剂量的辛伐他汀均明显引起软组织炎症，但局部应用0.5 mg辛伐他汀可以明显减少临床炎症且成骨作用明显[7，8]。

本实验存在一定的缺陷。为了比较哪种造模方式更有利于实验效果，我们设计了预实验：先建立兔肩袖损伤模型，1周后再行二次手术。研究结果发现：二次手术给药时冈上肌肌腱与周围组织界限不清，瘢痕粘连较重，部分肌腱存在脂肪化且张力较大难以拉回骨槽。考虑到手术难度及肌腱质量问题，我们设计了兔肩袖损伤修复模型。而该模型的缺陷就是术中的兔肩袖均为急性损伤，肌腱质量较好。而人的肩袖损伤90%为慢性。

4 结论

局部应用辛伐他汀/甲基纤维素凝胶能够促进兔肩袖损伤术后腱-骨愈合，增强腱骨界面的生物力学强度。