大孔吸附树脂纯化左金丸总生物碱工艺研究

龚来觐，李鹤，杨芳

(江西农业工程职业学院 中医药学院，江西 樟树 331200)

左金丸出自《丹溪心法》，为朱丹溪名方之一。该方由黄连、吴茱萸按6：1的剂量组成，具有清泻肝火、降逆止呕之效。现代药理研究其有多方面作用，而抗溃疡为最主要的药理作用之一[1]。具有抗溃疡药理作用的主要活性物质为生物碱类化合物，因此,此类化合物含量的高低直接决定了临床疗效。我们通过研究发现，不同溶剂提取的左金丸活性部位对大鼠胃溃疡均有不同程度的抑制作用，其中盐酸-乙醇(1∶100)组对胃溃疡的抑制率最高[2]，但其活性部位的纯化工艺研究尚未见报道。本文以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的吸附率及解吸率为指标，筛选了大孔树脂型号及纯化工艺参数，并采用单因素实验和正交试验确定最佳工艺条件，为左金丸抗溃疡活性部位的制备提供了实验依据，为进一步研发抗溃疡新药提供了理论基础。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器设备

高效液相色谱仪(Agilent1260液相色谱)；C18ODS-Box柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；UV-3300紫外-可见分光光度计、石英比色皿(上海美谱达仪器有限公司)；BS-124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；小型粉碎机(北京兴时利和科技发展有限)；RE 5298A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 实验药物与试剂

盐酸小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为110713-201708、110802-201709、110801-201709、110733-201609、110732-201611)；黄连与吴茱萸均购于樟树药材交流中心，经学院龚福保教授鉴定，黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎，吴茱萸为芸香科植物Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果实；大孔吸附树脂NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-100树脂(天津市海光化工有限公司)；甲醇(色谱纯，美国默克公司)；实验用水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取左金丸粗粉28 g(黄连∶吴茱萸6∶1)，置于500 mL锥形瓶中，加盐酸-乙醇(1∶100)300 mL静置30 min，超声提取40 min，提取过程中溶剂挥发可再加入适量盐酸-乙醇(1∶100)，冷却，抽滤，滤液45℃下减压浓缩至近干，加入适量甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，加甲醇定容即得样品液(生药量0.28 g·mL-1)；精密吸取样品液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释定容，0.45 μm微孔滤膜滤过， 即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱适量，分别加甲醇溶解，制成每1 mL中含盐酸小檗碱8.6 mg,盐酸巴马汀8.1 mg,盐酸药根碱10.6 mg,吴茱萸碱1.25 mg,吴茱萸次碱1.5 mg的对照品溶液储备液。

2.3 色谱条件

色谱柱ODS-Box(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-25 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(B，pH 4.5)，梯度洗脱(0～35 min，10%～45%A；35～65 min，45%～60%A)；柱温：25℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：10 μL[3-4]。

2.4 树脂的预处理

分别取NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-1005种型号大孔树脂置于层析柱中，加入高于树脂层10 cm的95%乙醇浸泡24 h充分溶胀后，再用95%乙醇洗，至流出液加蒸馏水不浑浊为止，最后用蒸馏水洗至水液澄清无醇味，备用[5-6]。

2.5 树脂型号的选择

2.5.1 静态吸附的考察

预处理好的5种型号大孔吸附树脂各取3份，每份准确称2.0 g后分别放于15个250 mL锥形瓶中，各加入20 mL样品液(生药量为0.28 g·mL-1)，磁力搅拌20 min，静置过夜(约12 h)，使树脂吸附药液至饱和，过滤，适量蒸馏水冲洗树脂，合并滤液，水浴蒸干。残渣加甲醇20 mL超声溶解20 min，过滤，滤液挥干，甲醇溶解并定容至5 mL，过滤，通过测定盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量计算吸附率，结果见表1。其中综合评分为5种成分平均吸附率之和除以5。吸附率的计算公式如下：

吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100%

C0上样液质量浓度，Ce为吸附平衡后滤液质量浓度。

表1 5种大孔树脂静态吸附5种成分平均吸附率(%,n=3)

由表1可知，5种树脂中综合评分最高依次为AB-8>D-101>NKA-9>HPD-100>DM-301，其中AB-8对5种成分的平均吸附率为77.83%，D-101平均吸附率为70.42%。没有明显差异，故对AB-8和D-101进行动态考察[7]。

2.5.2 动态吸附的考察

将预处理好的AB-8和D-101两种树脂各5 mL分别装入2根同样规格的层析柱中，再各取20 mL样品液(生药量为0.28 g·mL-1)分别上样，以0.1倍柱体积·min-1流速进行动态吸附，然后水洗脱至流出液Molish反应阴性，再依次用30%，50%，70%，95%的乙醇各30 mL洗脱，分别收集各部分洗脱液，减压浓缩干，残渣用甲醇25 mL超声溶解20 min，过滤掉不溶物，滤液挥干后甲醇溶解定容至5mL，过滤，通过测定5种成分含量计算转移率，结果见表2。其中综合评分为5种成分转移率之和除以5。转移率的计算公式如下：

转移率=洗脱量/上样量×100%

表2 2种大孔树脂动态吸附5种成分转移率及综合评分(%)

由表2可知，AB-8的综合转移率为83.65%，D-101的综合转移率为58.41%，AB-8明显优于D-101，故选用AB-8型大孔树脂对左金丸药液进行进一步工艺参数的优化。

2.6 AB-8型大孔树脂分离富集条件优化

2.6.1 正交试验对工艺参数的优化

通过预实验我们发现上样药液浓度(A)、上样流速(B)、树脂的径高比(C)、洗脱剂浓度(D)对成分的洗脱率有较大影响，因此选上述4个因素为考察因素，设计L9(34)正交试验因素水平表(见表3)。分别收集各组条件洗脱液，选择5种成分洗脱率考察，平行实验3次，3次的平均值见表4。综合评分为5种成分洗脱率的平均值，对每组数据综合评分的方差分析见表5，各因素水平综合评分的K值见表6。

表3 AB-8型大孔树脂优化工艺正交试验因素水平表

表4 正交试验结果各组洗脱率平均值(%,n=3)

表5 方差分析表

F0.01(2,2)=99，F0.05(2,2)=19

表6 AB-8型大孔树脂优化工艺正交试验洗脱率综合评分K值

实验结果表明，因素A(上样药液浓度)，B(上样流速)，C(径高比)，D(乙醇浓度)具有显著性差异，最佳工艺为上样药液浓度0.14 g/mL,上样流速9 BV/h，径高比1∶10，70%乙醇洗脱。

2.6.2 泄露曲线

量取预处理好的AB-8大孔吸附树脂20 mL装入层析柱(径高比约1∶10)，再将稀释一倍的样品液(生药量为0.14 g/mL)上样，上样流速为9BV/h。每试管收集5 mL流出液，共收集20试管。测定每试管中盐酸小檗碱、吴茱萸碱含量，以每试管中盐酸小檗碱、吴茱萸碱质量为纵坐标，累计上样体积为横坐标，绘制泄露曲线，见图1。由图1可知，上样60 mL后盐酸小檗碱、吴茱萸碱开始明显泄露，因此上样量最多8.4 g，即最佳上样量与树脂体积比为1∶2.4。

图1 泄漏曲线

2.6.3 洗脱剂用量的考察

将0.14 g/mL样品溶液按上样量与树脂体积比1∶2.4上柱(径高比约1∶10，湿树脂体积10 mL)，进行动态吸附3 h，然后用2 BV水洗脱将杂质去除，再用70%乙醇将成分洗脱，收集乙醇洗脱液，前2试管每试管收集10mL，以后每试管收集5 mL，共收集15试管，测定每试管中盐酸小檗碱、吴茱萸碱含量。以每试管中盐酸小檗碱、吴茱萸碱质量为纵坐标，累计洗脱体积为横坐标，绘制洗脱曲线，见图2。由图2可知当洗脱溶剂为70 mL时，可同时将盐酸小檗碱、吴茱萸碱洗脱完全，即洗脱剂用量为7 BV。

图2 洗脱曲线

2.7 验证试验

按优选的最佳纯化工艺，即以质量浓度为0.14 g/mL(相当于原生药)，上样量为2.4倍树脂体积的左金丸乙醇提取液上树脂柱(径高比1∶10)后，先以2BV蒸馏水除去杂质，再用7 BV体积分数70%乙醇洗脱，以9 BV/h流速收集体积分数70%乙醇洗脱部分。以HPLC法测定各成分的吸附-洗脱转移率，结果见表7。

表7 工艺验证5种成分吸附率、洗脱率、转移率

由表7可知，左金丸中5种成分精制后含量保留均在75%以上，其中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱3种成分保留85%以上，说明采用大孔树脂对左金丸盐酸-乙醇(1∶100)提取液进行精制是合理可行的。

3 讨论

有文献报道[8-10]左金丸可以通过调节胃酸分泌及促进胃黏膜愈合等作用来达到抗胃溃疡的效果，黄连在方中发挥最主要的药效，其中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱3种成分水溶性强，容易吸收入血，本课题前期研究还发现吴茱萸中的吴茱萸碱、吴茱萸次碱2种成分对幽门螺旋杆菌有较强的抑制作用，因此将以上5种成分作为优选左金丸精制工艺的检测指标。

虽然左金丸只由两味药组成，其抗溃疡有效成分主要为生物碱类化合物，但提取液中仍有多糖、蛋白质、鞣制等杂质，这些杂质用一般的纯化方法不易分离完全，且主要成分损失较大，因此选择一种纯化效果好的大孔树脂十分必要。从盐酸小檗碱、吴茱萸碱等的化学结构看都含有2～3个苯环，吴茱萸碱、吴茱萸次碱的极性较小，疏水性强，而盐酸小檗碱有一定的亲水性，因此将这5种有一定极性差异的化合物完全吸附洗脱有一定难度。AB-8型大孔吸附树脂为聚苯乙烯型弱极性吸附树脂，对环状芳香族化合物有很强的吸附能力，特别随被吸附分子亲油性增加而增强，这可能是对吴茱萸碱吸附好的原因。由于AB-8型树脂表面有一定的酯基，其亲水性有一定改善，这可能是对盐酸小檗碱这类化合物也能有较好吸附的原因。

经AB-8大孔树脂纯化后，所得干浸膏中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱5种成分的转移率分别为89.06%，87.23%、85.35%、79.72%、78.47%，所得干浸膏颜色为黄色至黄褐色，干燥后不易吸湿，由此可见糖类、蛋白质、鞣质等杂质去除较彻底，纯化后主要5种生物碱的含量都有很大提高，为左金丸抗溃疡活性部位总生物碱提取物的制备工艺提供了实验依据，也为进一步左金丸抗溃疡药效物质基础研究，谱效关系研究奠定基础。