文冠果果壳提取物抗氧化活性和抑菌活性研究

齐国雨，杨爱梅，郑泽生，韩娜，张富禄，尚晖岚

(兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)，为无患子科文冠果属植物，为我国特有的珍稀木本油料作物[1]，其种子含油量40%～50%，种仁含油量高达65%[2]，文冠果油既是优质的食用油,也可以文冠果油为原料制备生物柴油[3]。文冠果的树干、树叶、种仁富含脂肪酸、氨基酸、皂苷、萜类、甾类多种具有生物活性成分[4]。这些活性成分对炎症、肿瘤、病毒、HIV、提高记忆力均具有显著疗效[5]。

目前文冠果的主要利用方式是对其种仁进行食用油或生物柴油的制备，废弃的文冠果果壳不仅造成了资源的浪费，亦对生态环境造成一定的负担。因此本文拟对文冠果果壳提取物进行初步的抗氧化试验和抑菌活性试验，以期为文冠果果壳的综合开发与有效利用提供科学依据。

1 材料

1.1 试验材料

文冠果果壳采自甘肃庆阳地区，由兰州理工大学生命科学与工程学院杨林副教授鉴定。受试细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),以上菌种保藏于兰州理工大学生命科学与工程学院中藏药提取分离技术实验室；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，抗坏血酸(Vc)(上海伊卡生物技术有限公司)、铁氰化钾、三氯乙酸(TCA)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma公司)、过氧化氢、硫酸亚铁等。

1.2 主要仪器与实验设备

可见光分光光度计(721型),上海精科仪器有限公司;电子天平(FA2014),上海良平仪器仪表有限公司;旋转蒸发仪(RE-52A),上海亚荣生化仪器有限公司;培养箱,江苏中和实验仪器制造有限公司;超净工作台,江苏净化设备有限公司;高压灭菌锅；恒温震荡器；离心机。

2 方法

2.1 文冠果果壳95%乙醇提物及各极性萃取物的制备

文冠果果壳粉碎，过100目筛，取文冠果果壳粉200 g置于圆底烧瓶中，加入2 000 mL 95%工业乙醇，70℃回流提取3次，合并提取液，减压浓缩回收乙醇得总浸膏。将所得总浸膏用60℃～70℃的蒸馏水溶解，然后依次用石油醚(1 000 mL)、乙酸乙酯(1 000 mL)、正丁醇(1 000 mL)进行萃取(每种溶剂萃取3次，每次6～8 h)，合并萃取液，减压浓缩后得各极性萃取物。

2.2 体外抗氧化活性试验

(1)DPPH自由基的清除能力试验

试验组：移取样液2 mL于试管中，加入0.05 mg/mL的DPPH乙醇溶液2 mL，摇匀，避光30 min，测其吸光度A样品(517 nm)。空白组：无水乙醇设定为空白对照，测定吸光度A空白(517 nm)。对照组：以无水乙醇替代DPPH乙醇溶液，测定吸光度值A对照；抗坏血酸(Vc)为阳性对照，平行试验3组。根据公式：清除率(%)= [1 - (A样品- A对照) /A空白]×100%计算清除率。

(2)羟基自由基的清除能力试验

试验组：移取样液2 mL于试管中，加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，1 mL 0.1% H2O2溶液，10 mL定容，摇匀，37℃恒温保温0.5 h，测定吸光度A样品(510 nm)。对照组：以蒸馏水代替0.1% H2O2溶液，测定吸光度A对照(510 nm)。空白组：以2 mL无水乙醇代替样品溶液，测定吸光度A空白。抗坏血酸(Vc)为阳性对照，平行试验3组。按公式：清除率(%)= [1 - (A样品-A对照)/A空白]×100%计算清除率。

(3)总还原力试验

移取2.5 mL样液于试管中，加入0.2 mol/L pH为6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀。水浴(50℃)20 min中后，迅速冷却。加入10% TCA溶液2.5 mL，混匀，离心5 min(5 000 r/min)吸取上清液5 mL，向其中加入蒸馏水4 mL和 0.1% FeCl3溶液1 mL，混匀，静置10 min，700 nm测定吸光度值(700 nm)。抗坏血酸(Vc)为阳性对照，平行试验3组。

2.3 提取物抑菌活性试验

本试验以5种常见治病细菌为研究对象，采用牛津杯法[6-8]对文冠果果壳95%乙醇粗提取、石油醚萃取物、乙酸乙醋萃取物和正丁醇萃取物进行抑菌活性测定。吸取200 μL各菌种菌悬液于牛肉膏蛋白胨培养基上，均匀涂布，将无菌牛津杯立于培养基表面，轻压，无空隙接触培养基[9-11]。将不同浓度梯度待测样液注入牛津杯中，以二甲基亚砜(DMSO)做空白对照，青霉素和硫酸链霉素为阳性对照品。恒温培养箱37℃静置培16～18 h后观察受试菌生长状况，记录结果。

3 结果与分析

3.1 体外抗氧化活性试验

3.1.1 DPPH自由基的清除能力试验结果

结果如图1、表1所示，石油醚萃取部位对DPPH自由基基本没有清除能力，其余各部位对DPPH自由基均存在不同程度的清除能力，且样品浓度达到0.5 mg/mL时，样品与阳性对照品(Vc)均清除率均达到最大。

3.1.2 羟基自由基的清除能力试验结果

结果如图2、表2所示，95%乙醇提取物及各极性萃取物对H2O2与FeSO4反应所产生的·OH清除能力低于阳性对照品(Vc),其中95%乙醇提取物对·OH清除率基本为0，正丁醇部位萃取物对·OH清除能力最强，当浓度为0.25 mg/mL时，清除率不到10%。

图1 提取物对DPPH自由基的清除能力

浓度石油醚乙酸乙酯正丁醇乙醇维生素C0.010.103 1000.081 90.235 00.020.137 800.007 30.140 40.368 00.040.335 30.036 80.011 00.266 60.702 00.050.516 60.116 30.016 90.333 10.852 00.10.835 20.517 70.061 70.575 60.923 00.20.957 90.894 50.127 20.831 40.967 70.50.959 30.961 70.261 00.929 40.968 00.750.972 40.951 70.358 00.928 90.968 3

图2 提取物对羟基自由基的清除能力

浓度石油醚乙酸乙酯正丁醇乙醇0.010.014 40.013 70.016 10 0.020.024 80.045 00.047 90.002 00.040.053 60.057 70.082 60.003 00.080.061 10.068 90.085 40.004 50.160.064 10.072 60.090 10.005 10.20.068 00.073 50.095 10.008 20.250.069 10.077 90.100 10.019 3

3.1.3 总还原力试验结果

结果如图3、表3所示，阳性对照品(Vc)还原能力强于95%乙醇提取物和各极性萃取物。石油醚萃取物基本没有还原能力，其余部位均具有不同程度的还原能力，吸光度值与浓度存在一定的量效关系，测试浓度范围内线性关系良好。还原能力与待测物浓度成剂量依赖性，还原能力与斜率成正比。

图3 提取物总还原能力测定

浓度石油醚乙酸乙酯正丁醇乙醇维生素C0.020.060 00.108 50.120 00.104 50.135 00.040.069 00.115 00.135 00.155 00.186 30.060.079 50.224 50.149 00.199 50.253 60.080.089 50.279 00.174 00.234 00.335 20.10.099 50.318 00.201 00.291 00.420 30.120.106 00.397 00.221 00.328 00.510 30.140.121 00.442 50.250 00.382 00.612 40.160.125 00.505 00.268 50.391 00.721 5

3.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定

95%乙醇提取物及各极性部位萃取物对五种受试细菌最低抑菌浓度的确定,结果见表4。四个样品对五种受试细菌在较低浓度均有抑菌作用。其中乙酸乙酯萃取物对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌以及地衣芽胞杆菌最低抑菌浓度为2.5 mg/mL，表明乙酸乙酯萃取物中含有抑菌活性成分，有必要进一步跟踪分离研究该部位的化学成分。正丁醇萃取物在较低浓度下对五种受试菌均有抑菌作用，其中对大肠杆菌最低抑菌浓度为2.5 mg/mL。

表4 样品对五种受试细菌的MIC值确定结果(mg·mL-1)

4 结论与讨论

结果表明, 文冠果果壳95%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物均具有清除DPPH自由基活性、清除羟基自由基活性以及还原力。但活性与阳性对照品抗坏血酸(Vc)相比较低。样品对金黄色葡萄球菌 、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌均具有较好的抑菌活性，其中乙酸乙酯萃取部位抗氧化活性及抑菌活性均较好，将在后续研究中对其中的抑菌及抗氧化活性单体成分进行跟踪分离。