通腑化浊凉血方对慢性肾衰竭模型大鼠硫酸吲哚酚清除的影响

蔡燕杰，孙晓光,桑小普，马重阳，翟昌明，程发峰

(北京中医药大学中医学院，北京 100029)

慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)是指慢性肾脏病引起的肾小球滤过率下降及与此相关的代谢紊乱和临床症状组成的综合征[1]，其影响因素颇多，发病因素复杂，防治需多方面合作，近些年来发病率呈明显提高的趋势，严重威胁着人类的健康[2]。

近年来，有研究发现在CRF患者的肠道内，有大量未知的代谢产物，其中有一类是潜在的尿毒症毒素，这些尿毒症毒素主要分为4类：小分子毒素、中分子毒素、与蛋白结合的小分子化合物和蛋白质等[3]，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfuric,IS)是目前研究较多的肠源性尿毒症毒素之一。这些尿毒症毒素经过一系列途径进一步加重CRF的进程和并发症的发生。本实验旨在观察通腑化浊凉血方对慢性肾衰竭大鼠血清中IS的清除效率，为IS的清除策略以及慢性肾脏病的治疗方案提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠60只，体质量(180±40)g，由北京中医药大学科研实验中心实验动物部提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 药物与试剂

通腑化浊凉血方(组成：荆芥6 g，防风6 g，白芷6 g，独活6 g，生地榆10 g，赤芍10 g，丹参10 g，茜草10 g，萆薢30 g，土茯苓30 g，生大黄10 g，为北京同仁堂药业股份有限公司提供)；尿毒清颗粒(广州康臣药业有限公司)；硫酸吲哚酚标准品(美国Sigma公司)；甲醇(北京百诺威生物科技有限公司)；乙腈(德国 Merck 公司)；三氟乙酸(上海钰博生物科技有限公司)；青霉素钠(华北制药股份有限公司)；水合氯醛(北京百诺威生物科技有限公司)。

1.3 主要仪器

Waters515型高效液相色谱仪;配717型自动进样器;2475型荧光检测器(美国Waters公司);BDS HyPersil C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特);METTLER TOLEDO AL-204电子分析天平(梅特勒仪器上海有限公司);KH19A型台式高速高性能离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);MVS-1旋涡混合器(北京金紫光科技发展有限公司产品)。

1.4 造模与分组

慢性肾衰竭大鼠模型的建立按照文献报道的方法造模，建立5/6肾切除法慢性肾衰竭大鼠模型。手术组(包括模型组，通腑化浊凉血方高、中、低剂量组，尿毒清组)均在无菌条件下进行5/6肾切除术，空白组不作任何处理。5/6肾切除术分两次完成。第一次手术切除左肾上、下极各1/3，在一周后进行第二次手术，切除整个右肾[4]。两次手术在手术过程中均在腹腔内注入注射用青霉素钠1 mL，由内而外缝合，术后单笼饲养并观察，以确保大鼠术后生存率。

按照随机数字表随机分为空白组、模型组(等量生理盐水)、通腑化浊凉血方高剂量组、通腑化浊凉血方中剂量组、通腑化浊凉血方低剂量组和尿毒清组,每组10只，于动物房中适应性饲养1周，环境要求温度、湿度均恒定。

1.5 中药的备制与给药

以人的等效剂量记作中剂量，1/2倍等效剂量为低剂量，2倍为高剂量，按照人与大鼠体表面积换算公式，中药以蒸馏水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并煎液，并将所得药液用双层纱布过滤，水浴加热蒸发浓缩至含生药分别为0.5 g/mL、1 g/mL、2 g/mL，放在4℃冰箱中备用。中药的每日灌胃量为0.2 mL/10 g体质量。

从第5周开始，开始灌胃给药。模型组每日给以0.2 mL/10 g体质量生理盐水，通腑化浊凉血方组按照高中低剂量每日大鼠每日0.2 mL/10 g体质量汤药，尿毒清组每日0.2 mL/10 g尿毒清颗粒溶液，至第16周结束。空白组不作任何处理。

此16周在整个实验过程中所有大鼠进水及饮食均不受限制。

1.6 取材时间

在第4周末，每组中随机抽取3只大鼠，头身部固定，局部消毒后于尾静脉取血，检测肌酐、尿素氮水平，数据显示慢性肾脏病大鼠造模成功。

在第16周末采集血、尿标本。采集尿标本用代谢笼留取SD大鼠24 h尿标本，同时禁食。收取后立刻送检。采集血标本于12 h前将各组SD大鼠禁食、禁水。大鼠称质量后，以0.3 mL/100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉成功后予腹主动脉采血，保存于无肝素采血管中，静置30 min，离心机3 000 r/min离心，用移液枪移取出血清上清液20 μL，10 min后将血清样本送检。

1.7 血清生化和尿蛋白检测

生化检测大鼠尿素氮、肌酐、尿酸以及大鼠24 h尿蛋白定量，委托北京中医药大学科研楼全自动生化分析室检测。

1.8 硫酸吲哚酚检测

采用高效液相色谱-荧光分析法检测血清中硫酸吲哚酚含量。用移液器精密吸取血清100 μL，加入300 μL乙腈后涡旋30 s，待二者充分混合，以12 000 r/min转速离心8 min。吸取200 μL上清液，进样时取10 μL置于自动进样小瓶中进行分析。色谱分离通过BDS HyPersil C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特)完成，流动相为乙腈-水-三氟乙酸(15：85：0.2，V/V/V)；流速为1 mL/min；柱温：40 ℃；激发波长280 nm，发射波长390 nm。IS标准曲线设定为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg/mL。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

空白组大鼠的动作敏捷，体毛致密光滑、整齐有光泽，耳廓、口唇、眼鼻黏膜红润，体质量正常增长，尿量正常，尿色淡黄，大便成形质偏硬，饮水饮食均正常。

模型组大鼠逐渐出现精神萎靡的现象，身体多蜷缩，且反应迟钝，活动迟缓，口唇等黏膜苍白无血色，皮毛无光泽，毛量偏少，食少饮多，大便溏稀，尿量多，体质量增长缓慢。

尿毒清组整体状况较模型组相比有改善，但较通腑化浊凉血方各组差。

通腑化浊凉血方各组在毛色、口唇黏膜颜色方面较模型组明显改善。精神状态较活跃，体质量增长较正常。

2.2 通腑化浊凉血方给药3个月后各组血清尿素氮与肌酐水平的变化

表1 给药3个月后各组血清尿素氮与肌酐水平的变化

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

3个月后模型组血清尿素氮(BUN)与肌酐(SCr)水平均较两个月上升，表明本模型慢性肾衰持续进展，且不能自陷。与模型组相比，通腑化浊凉血方中、高剂量均可以降低模型大鼠血清BUN水平(P<0.05)，三个剂量均能够明显降低SCr水平(P<0.05)，证明本方具有缓解肾功能衰竭的作用。

2.3 通腑化浊凉血方给药3个月后尿蛋白水平的变化

24 h尿蛋白定量检测结果显示，通腑化浊凉血方给药3个月后，与正常对照组相比，模型组大鼠出现明显蛋白尿(P<0.01)。与模型组比较，三个剂量通腑化浊凉血方组大鼠24 h尿蛋白均有不同程度下降(P<0.01)，提示通腑化浊凉血方对大鼠肾衰后蛋白尿具有剂量依赖性治疗作用。

表2 给药3个月后24 h尿蛋白水平的变化

注：与模型组比较，**P<0.01

2.4 各组大鼠硫酸吲哚酚测定结果比较

慢性肾衰竭大鼠3个月血清IS水平较空白组明显上升(P<0.01)，低中高通腑化浊凉血方能够减少大鼠血清IS含量(P<0.01)，具有剂量依赖性。

表3 给药3个月后IS测定

注：与模型组比较，**P<0.01

愈来愈多的证据表明，在CRF的病理机制中，肠道和肾脏之间有着重要的联系，并提出了新的理论——“肠-肾轴”(Gut-Kidney Axis)[5]，肠道与肾脏之间的密切关系表现为，随着肾功能的减退,肾脏对溶质的清除率下降，血液和组织中不断蓄积毒性物质——尿毒症毒素，毒素使肠道菌群生态失调，菌群生态的改变使毒素的产生增加；同时，毒素造成肠道黏膜屏障功能紊乱，导致内毒素进入血液循环，形成肠源性内毒素血症；毒素还可以通过肠道动力障碍、免疫功能异常、全身炎症反应等途径进一步加重CRF的进程和并发症的发生[6-8]。

现在慢性肾衰竭常用的治疗手段是肾替代，如血液透析、腹膜透析等方法，成本均较高，且对于IS等蛋白结合型毒素清除率较低，容易对患者的生活质量产生影响[9]。

赵绍琴教授是治疗肾病的大家，通过多年的临床总结出一整套CRF的辨证方法，赵老认为，CRF是泌尿系统疾病，不能等同于中医“肾”的概念，其基本病机为风、湿、热邪深入营血，脉络瘀阻，其病属实非虚，多热多瘀。彭建中教授是赵绍琴教授的学术继承人，在秉承赵绍琴学术思想的基础上，对该病进行了更为深刻认识，通过对大量临床病例的观察与总结，认为CRF不仅是泌尿系统的疾病，更与胃肠道消化系统密切相关，并将本病的关键环节定义为“湿热毒”，研究出通腑化浊凉血方。此方是基于两代名中医的学术经验创立而成的，是彭建中教授治疗慢性肾衰竭的基本方，临床疗效显著，并在动物实验中得到验证[10]。

通腑化浊凉血方的立方宗旨在于解决CRF中蓄积在肾与三焦的“湿热毒”。其药物组成中的生大黄苦、寒，归脾、胃、大肠经，通腑导滞，减少肠道内腐败物的潴留时间，改善肠道菌群的失调状态，使毒素的产生来源减少；萆薢苦、平，归肾、胃经，土茯苓甘、淡、平，归肝、胃经，化浊排毒，降低体内已经产生的毒素；荆芥、防风、白芷、独活疏风祛湿，生地榆、赤芍、丹参、茜草凉血活血，清热解毒，减轻毒素导致的毒性作用。全方共奏通腑导滞、化浊排毒、凉血解毒之效。大肠属下焦，本是糟粕形成的部位，更加容易感受“湿热毒”邪。在肠道内发现的尿毒症毒素极有可能是中医所说的“湿热毒”邪，或是通腑化浊凉血方的作用靶点。

实验证明，通腑化浊凉血方可以增加CRF模型大鼠排便次数，改善食欲，降低血中的IS含量，但对IS的干预机制目前尚未可知。研究通腑化浊凉血方对IS的干预机制或能发现该方治疗CRF的机制之一，从而为临床治疗慢性肾脏病提供思路。

慢性肾衰竭是现如今临床上一种难治的疾病，寻找有效的治疗措施是亟待解决的问题。努力挖掘中医药治疗慢性肾衰竭的经验价值，是中医药学者的职责。我们应在秉承中医传统的基础上，挖掘名老中医宝贵的临床经验，结合现代研究进展与先进的实验技术，发扬中医药在治疗慢性肾衰竭方面的积极作用，为IS等类尿毒症毒素的清除策略和慢性肾衰竭的治疗方案提供新的思路与方法。