柴贝胃炎康对应激性胃溃疡及慢性胃溃疡的实验研究

王香雨，陈百灵，李红杰，贾庆忠*

(1.河北医科大学药理教研室，河北 石家庄 050017；2.定州市中医院，河北 定州市 073000)

柴贝胃炎康是一个由柴胡、芍药、枳实等多味药材组成的临床经验方处方由传统方剂“四逆散”和“左金丸”加减裁化而成。四逆散源于《伤寒论》可用于肝胃不和引起的胃痛、腹痛。有研究表明四逆散加减方可治疗急慢性应激性胃溃疡[1]。左金丸是《丹溪心法》中的名方主治肝火犯胃证、胁肋疼痛、嘈杂吞酸。现代研究表明左金丸具有抑制基础泌酸和抗溃疡的药理作用[2]。柴贝胃炎康以柴胡为君药配伍枳实、白芍、黄连等治疗急慢性胃溃疡。有临床研究表明四逆散合左金丸合方可治疗胆汁反流性胃炎、功能性消化不良[3-4]。但尚未有实验研究该合方对应激性胃溃疡及慢性胃溃疡的治疗作用。应激性胃溃疡及慢性胃溃疡临床发病率高但其发生的确切机制尚不明确因此防治效果不理想。因此寻找对应激性胃溃疡及慢性胃溃疡的药物意义重大。本实验所用四逆散合左金丸加减方以生药微粉方式经口给药提高了吸收度，方中以柴胡为君药，具有疏肝利胆、理气解郁以祛发病之源；枳实疏散行气，有驱肝郁气滞之功效；白芍益肝扶脾；黄连清泻肝火，可治肝火犯胃之症。配以海螵蛸等名贵药材，可治疗胃溃疡等多种胃部疾病。采用急性水浸应激模型和乙酸灼烧慢性溃疡实验动物模型观察该方对胃组织形态、胃溃疡面和胃酸分泌、胃蛋白酶含量等指标的影响评价其主要药效作用。

1 材料与方法

1.1 试验药物

柴贝胃炎康胶囊由北京祥和康健科技发展有限公司生产,产品批号：20150907。

奥美拉唑浙江华立南湖制药有限公司生产，规格20 mg/片批号：151003。

1.2 动物清洁级

KM小鼠雌雄各半，体质量18～20 g,由河北省实验动物中心提供合格证号：1601187。SPF级SD大鼠雌雄各半，体质量180～250 g,由中国食品药品检定研究院提供合格证号：11400500012734。

1.3 试剂

冰醋酸购于天津市永大化学试剂有限公司批号20130824。

1.4 仪器

电子天平,梅特勒—托利多(上海)有限公司生产,型号:AL204。解剖显微镜,OLYMPUS公司生产,型号:SZX12。显微镜,Olympus公司生产,型号:CH型。微量注射器,上海医用激光仪器厂生产,型号:0.25 ML。切片机,德国Leica公司生产,型号:RM2135。摊片机,中国天津航利达公司生产,型号:TP-1。烘片机,中国天津航利达公司生产,型号:HP-1。病理工作站,德国Leica公司生产,型号:DM2500。

1.5 方法

1.5.1 应激性胃溃疡实验分组、给药和取材

KM小鼠60只体质量18～20 g,按性别、体质量随机分为5组,每组12只。设模型对照组、阳性对照组(奥美拉唑8 mg/kg)、供试品三个剂量组,0.6 g、1.2 g、2.4 g/kg相当于临床推荐剂量的6、12、24倍。药物组采用等容积不等浓度灌胃,每日1次，给药容积为0.1 mL/10 g体质量。模型组给予等量0.5%的CMC-Na,每日1次。连续5 d,第4天开始禁食不禁水。第5天给药后30 min,将小鼠仰卧固定于铁丝网板，浸于(20±1)℃水槽内,水面齐剑突[5]。16 h后颈椎移位处死动物、剖腹、结扎幽门和贲门,向胃内注入1%福尔马林1.5 mL固定30 min。沿胃大弯将胃壁剪开，将其平铺透光玻璃板上,读取溃疡点数目或溃疡指数,并计算溃疡抑制率。

1.5.2 乙酸灼烧形成的胃溃疡实验分组、给药和取材

SD大鼠60只,体质量180～200 g，按性别、体质量随机分为5组，每组12只,雌雄各半。大鼠胃体与幽门交界处注入10% 醋酸50 μL，形成丘疹，制备酸刺激慢性溃疡模型，按性别、体质量随机分为模型对照组(0.5% CMC-Na),阳性对照组(给予奥美拉唑8 mg/kg),供试品低、中、高三个组(给药剂量分别为0.4 g、0.8 g、1.6 g/kg，此剂量分别相当于临床推荐剂量4、8、16 倍)。以上各组动物均灌胃给药每日1次，连续灌胃14 d。术前禁食不禁水，末次给药后3h 在幽门与十二指肠结合部位结扎，术后6h 测量取胃内容物，用于测量胃蛋白酶活性、胃液总量及游离酸含量。沿胃大弯剪开,将胃壁展开，观察胃壁损伤情况并照相,用ImageJ软件分析胃壁损伤面积和愈合百分率。每组取6只胃组织置于10%福尔马林固定常规石蜡包埋切片苏木素-伊红染色(HE染色)作常规组织病理学观察。应用定量分析系统光镜下测定胃溃疡深度及炎症反应程度,按文献标准[6]并加以改进，用半定量法判定胃壁病变程度。见表1。

表1 组织病理学标准

1.5.3 指标观察与检测方法

1.5.3.1 溃疡指数

用溃疡长度总和(毫米数)作为溃疡指数，溃疡抑制率(%)=(对照组溃疡长度总和-给药组溃疡长度总和)/模型对照组溃疡长度总和×100%[6]。

1.5.3.2 胃酸测定

收集全部胃液于离心管中3 000 r/min 离心15 min吸取上清为胃液量。 胃液游离酸量：取胃液1 mL置于烧杯中用pH计监测pH，用20 mmol/L NaOH液滴定至pH=7时为游离酸滴定终点,记录消耗NaOH体积。消耗NaOH液毫升数×20×总胃液量为游离酸量(mmol)[7]。胃液总酸度： 取胃液1 mL置于烧杯中加入酚酞指示剂2滴,用0．02 mol/LNaOH液滴定至微红色、作为总酸度滴定终点。两次滴定消耗的NaOH液毫升数×20为总酸度(mmol/L)。总酸量=总酸度×胃液量(mmol)。单位时间酸排出量(mmol/h) =总酸度×总胃液量÷6[7]。

1.5.3.3 胃蛋白酶活性采用Mett毛细玻管法

胃蛋白酶活性计算公式(U/ML)=平均值×16[8]。

1.5.3.4 胃内壁损伤面的测量

将损伤部位照相，图片导入电脑用ImageJ软件测量损伤面积，并计算。损伤面积比率=损伤面大小/整个胃内表大小×100%。

1.5.3.5 大鼠实验性胃溃疡组织病理学程度分级标准

取材：5组动物中每组取6只(雌雄各3只)：沿小弯打开胃，从前胃至腺胃纵切取3～5条组织，固定，脱水，制作蜡块。

1.6 统计学分析方法

2 结果

2.1 柴贝胃炎康胶囊对应激性小鼠胃溃疡模型的影响

与模型组比较，奥美拉唑组小鼠溃疡点数和溃疡面长度均显著减轻并且有统计差异(P<0.05)，柴贝胃炎康0.6 g/kg、1.2 g/kg、2.4 g/kg三个剂量组也有明显减轻趋势，并且0.6 g/kg和2.4 g/kg组有显著性差异(P<0.01)。高剂量组溃疡制率达67%，比奥美拉唑组49%还高，但无统计差异，详见表2。结果提示柴贝胃炎康对小鼠水浸应激性胃溃疡的有明显的保护作用。

表2 柴贝胃炎康对应激性胃溃疡模型小鼠的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 柴贝胃炎康对乙酸灼烧形成的胃溃疡大鼠模型的影响

2.2.1 对大鼠胃酸、胃液及胃蛋白酶分泌的影响

胃酸分泌情况可通过胃液中游离酸量、总酸量、总酸度和单位时间排酸量进行考察。与模型组比较，奥美拉唑无论是从泌酸总量还是从单位时间分泌量，减少程度均有非常明显差异 (P<0.01)，柴贝胃炎康低、中、高三个剂量组胃酸分泌减少，均有显著性差异(P<0.05)，结果详见表3。幽门结扎6 h后测量产生的胃液总量和胃蛋白酶活性，与模型组比较奥美拉唑对胃液量及胃蛋白酶活性均无显著影响(P>0.05)，柴贝胃炎康胶囊各剂量组对胃蛋白酶活性影响不明显，但是0.8 g/kg、1.6 g/kg 组胃液量显著减少(P<0.05)，胃蛋白酶活总量有增多趋势但无显著性差异(P>0.05)，详见表4。

表3 柴贝胃炎康对乙酸灼烧致大鼠胃酸分泌的影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

表4 对大鼠溃疡胃蛋白酶活性影响

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 对胃壁灼烧创面的愈合效果观察

通过ImageJ软件对胃壁损伤面积进行测量，以分析创面愈合效果，评价药物的治疗作用。与模型组比较，奥美拉唑明显减少损伤面积绝对值，同时降低损伤面积比例(P<0.01)。柴贝胃炎康低、中、高三个剂量组损伤面积比例也显著降低(P<0.01)，各剂量组与奥美拉唑组比较均无显著性，结果见表5。

表5 柴贝胃炎康对胃壁损伤面积比例的影响

注：与模型组比较，*P<0．05，**P<0．01

2.2.3 对胃溃疡组织病理学的影响

每组取6只动物，将损伤部位胃组织取材后固定，HE染色观察(见图1)。模型组6只动物中4只均出现黏膜至肌层新鲜出血、黏膜下层淤血以及膜局部坏死和局部肌肉坏死。另外两只动物出现轻度黏膜下层水肿及局部黏膜增厚。奥美拉唑组可见1例黏膜层黏膜下层和肌层的新鲜出血，其它5只动物胃组织出现轻度黏膜下层水肿及局部黏膜增厚。柴贝胃炎康高剂量组可见一例雄性动物胃浆膜层区域性炎细胞浸润；中剂量组可见1例黏膜下层区域性新鲜出血，浆膜外异物肉芽肿；低剂量组可见轻度黏膜下层水肿及局部黏膜增厚。将每只动物病理观察结果进行半定量评分(见表6)，结果提示柴贝胃炎康可促进乙酸灼烧引发的溃疡面愈合。

表6 柴贝胃炎康对乙酸灼烧胃组织病变程度的评分影响

注:A.为模型组;B.为阳性药奥美拉唑组;C.为柴贝胃炎康0.4 g/kg剂量组;D.为柴贝胃炎康0.8 g/kg剂量组;E.为柴贝胃炎康1.6 g/kg剂量组；M.表示雄性;F.表示雌性图1 柴贝胃炎康对乙酸灼烧致胃溃疡大鼠组织病理学影响

3 讨论

实验性胃溃疡模型造模方法很多，包括水浸应激、幽门结扎、乙醇灌胃、非甾体抗炎药及利血平等药物诱导、乙酸或磷酸刺激等方法[9]。其中水浸应激致胃溃疡的动物模型，主要是由于消化系统易受环境和情绪的影响，利用小鼠惧水习性造成一定程度的心理应激，由此导致中枢下丘脑—垂体—肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary- adrenal axis，HPA)被激活，从而使大脑皮层调控失衡，释放大量儿茶酚胺类神经激素，收缩胃壁血管及毛细血管，使胃黏膜微循环血流量减少、黏膜缺血，导致营养物质和氧气减少表皮细胞损伤后无法修复再生；继发性的氧自由基增加使得血管通透性增加以及黏膜水肿。由于胃黏膜微循环血流量是重要的胃黏膜保护屏障，胃黏膜缺血而形成应激损伤均出现不同程度溃疡甚至糜烂[10]。本方中君药柴胡、枳实为君药可疏肝解郁、行气散结从中医理论来说肝主疏泄促气血于全身可促进胃部微循环合理再分布。从而达到治疗溃疡的作用,本实验结果也显示合方对于抑制溃疡有效果。

总之，通过对“四逆散”和“左金丸”等经典名方加减裁化而成的柴贝胃炎康胶囊，无论是对水浸应激导致的急性胃溃疡，还是对乙酸刺激形成的慢性胃溃疡均表现出较好的治疗作用，提示在其拟定的临床使用剂量下可用于急慢性胃溃疡的治疗。