美国和澳大利亚进境棉花中的霉菌测试及危害分析

2019-03-20连素梅孙晓霞娄巧哲李轲胡连霞牛增元郭会清

棉花科学 2019年1期

连素梅，孙晓霞，娄巧哲，李轲，胡连霞，牛增元，郭会清

（1.河北出入境检验检疫局技术中心，河北石家庄 050051；2.河南出入境检验检疫局技术中心，河南郑州 450003；3.山东出入境检验检疫局技术中心，山东青岛 266555）

0 引言

我国是纺织工业大国，也是全球棉花最大消费国，对棉花的需求量很大，仅靠国内棉花生产量远不能满足纺织工业的需求，因此每年需要通过进口棉花来弥补短缺，且进口数量很大。据国家质检总局统计，近三年我国从世界各国进口棉花12152批、312万吨，货物总值56亿美元，经检验共计对外索赔8752万美元，占货值的1.5%，为国家和企业挽回了巨大的经济损失。我国进口棉花主要来自美国、澳大利亚、印度、乌兹别克斯坦、巴西、贝宁、布基纳法索、希腊等，由于进口棉花产地不同以及种植、采摘、加工、储存、运输方式不同，除品质差异很大，随附着棉花携带来的各种有害生物也五花八门，对国民经济及接触人员危害很大[1]，但并未引起相关部门高度重视。因此，作者重点对美国、澳大利亚等主要国别的进境棉花针对霉菌种类及含量进行分析，并提出安全防范措施。旨在促进棉花贸易的科学健康发展。

1 实验材料

1.1 样品

2017年进境的美国棉花样品（M-USA）和澳大利亚棉花样品（M-AUS）。

1.2 试剂

无菌磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水，孟加拉红琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂，营养琼脂，核酸提取试剂盒。

1.3 仪器设备

电子天平，拍击式均质器，恒温培养箱，生物安全柜，全自动微生物分析仪，全自动快速生物质谱检测系统，高速冷冻离心机。

2 实验方法及步骤

从无菌采集的棉花样品中称取25 g装入无菌袋中，倒入225 mL无菌磷酸盐缓冲液，拍击均质2 min，即为10倍的样液，再用无菌生理盐水按照10倍的梯度稀释，分别得到100倍和1000稀释倍数的样液。每个稀释梯度各吸取1 mL样液于3个无菌平皿中，分别倾注45℃的孟加拉红琼脂（培养出来的为霉菌），马铃薯葡萄糖琼脂（培养出来的为霉菌）和营养琼脂（培养出来的为细菌），混匀凝固，各做2个平行。孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂平板于28℃培养5d；营养琼脂平板于36℃培养48 h。观察记录计数结果，结果取两个平行的平均值。挑取各平板上的特征单菌落进行分离纯化，通过全自动微生物分析仪（VITEK 2.0）、全自动快速生物质谱检测系统（MALDI-TOF）以及基因测序进行鉴定。

按照样品霉菌数=[(孟加拉红琼脂菌落数+马铃薯葡萄糖琼脂菌落数)/2]×稀释倍数；样品细菌数=营养琼脂菌落数×稀释位数；进行统计和换算。

3 实验结果与分析

美国及澳大利亚棉花样品菌落培养计数结果参见表1。根据表1计算得出，美国棉花样品的霉菌计数结果为45 CFU/g，细菌计数结果为110 CFU/g；澳大利亚棉花样品的霉菌计数结果为270 CFU/g，细菌计数结果为720 CFU/g。

分别从美棉和澳棉的2个棉花标准样品中分离出霉菌5株，芽孢杆菌3株。经过全自动微生物分析仪（VITEK 2.0）、全自动快速生物质谱检测系统（MALDI-TOF）以及基因测序鉴定，这5株霉菌为黄曲霉、黑曲霉、阿曲霉、土曲霉、谢瓦利埃曲霉；芽孢杆菌分别为短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌。因棉花样品养分较为单一，霉菌主要是以孢子形态存在，芽孢杆菌则主要以芽孢形态存在[2]。

4 菌落形态与危害分析

从棉花采摘、加工、储存、运输方式来讲，在世界主要产棉国中，美国和澳大利亚的条件应该说是最好的，即便如此，在这两个国别进境的棉花中，还发现了上述霉菌，其他国家的加工、储存方式以及卫生状况相对差距很大，棉花中的霉菌状况更为堪忧。曲霉菌是一种典型的丝状菌，主要是靠散发在空气中的孢子增殖，具有很强的繁殖能力，因此曲霉菌对人类的危害较大，特别是对眼部很容易引起各种感染[3]。

4.1 黄曲霉

黄曲霉为半知菌亚门丛梗孢科曲霉属，且为需氧菌，最适温度30℃～33℃，相对湿度80%～90%为最佳条件。菌落形态是最初带黄色，然后变为黄绿色，老后颜色变暗，平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。在低倍显微镜下观察可见分生孢子头疏松放射状，继变为疏松柱状。分生孢子梗多从基质生出，长度一般小于1 mm。有些菌丝产生带褐色的菌核。分生孢子球形、近球形或稍作洋梨形，粗糙。黄曲霉会产生黄曲霉毒素，是一种有致癌性且有剧烈毒性的化合物。

表1 不同稀释度下的菌落培养计数结果

4.2 黑曲霉

黑曲霉为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。在高温、高湿环境下，黑曲霉容易大量生长繁殖产酶生热，侵染棉花时引起落花或烂铃，或生于多汁的果实上，引起腐烂或软腐，侵染洋葱鳞片表面生出大量黑粉；梅雨季节亦容易引起衣物发霉等。黑曲霉菌丝直径15～20 pm，长约1～3 mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状物，直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。菌丝呈黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑褐色，平滑或粗糙。由于该菌生长快速，极易通过空气扩散污染环境，对棉花接触及检验人员均构成威协。国内关于黑曲霉对人体致病性方面的研究较少，目前所见到的公开报道是福建省卫生防疫站与厦门市同安区肝癌研究所关于同安地区肝癌的高发病率与黑曲霉等曲霉菌的产毒较大有关。

4.3 土曲霉

土曲霉属于半知菌纲，壳霉目，杯霉科。菌落生长快，菌落小、圆形，呈肉桂色或土黄色。分生孢子头致密圆柱状，分生孢子梗细长而扭曲，顶囊半球状。分生孢子球形或近球形，壁光滑，孢子圆形到卵圆形。如果不小心耳道被土曲霉感染了，会出现中耳炎，出现耳鸣或肿涨等症状，如果肺部被土曲霉感染了，易引发肺炎。

4.4 芽孢杆菌

芽孢杆菌原来是独立生存的生物。世界上有很多种芽孢杆菌，它们就生活在土壤中，对人对动物都没有什么危害，如上述进境棉花样品中检出的短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌等。但炭疽芽孢杆菌危害很大，原因是它们除了染色体之外，还在进化过程中获得了额外的遗传物质。在炭疽芽孢杆菌中，那是两种不同的质粒。这种细菌产生两种毒素，一种叫致死因子，另一种叫水肿因子。这可能是最厉害的细菌毒素，只要有一个分子进入细胞，就能使细胞破裂死亡。正由于这些毒素，食草动物感染炭疽后，才会那么快死亡；也由于毒素破坏了血管的细胞，才会那么严重的出血，把细菌带出体外，造成无法控制的污染。