冰菜乙醇提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性①

李婷婷 蔡彩虹 郭志凯 戴好富 夏志辉 曾艳波③

(1 海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室 海南海口571101;2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室 海南海口571101;3 海南大学热带农林学院 海南海口570228)

冰菜（Mesembryanthemum crystallinumL.）属番杏科日中的一年生草本植物，又名冰叶日中花、冰草、冰花、水晶冰菜［1］。冰菜原产于南非纳米比沙漠等干旱地区，现在非洲、亚洲西部和欧洲等地区均有分布［2］。国内目前也在引种栽培，在云南、陕西、山东等地区已经有了冰菜的规模化种植［3］。冰菜因其叶子和茎的表面有大量凸起的盐囊泡细胞，在阳光照射下反射光线，看起来像冰晶一样美丽而得名［4］。近年来，随着生活水平不断提高，人们对具有保健作用的蔬菜越来越重视。冰菜中含有多种碳水化合物以及有机酸、酚类化合物、天然苹果酸、黄酮类化合物等，并且还含有钾、钙、钠等多种矿物质成分，是具有高营养价值的功能性蔬菜。并具有清除自由基和抗氧化活性、促进代谢、预防脂肪肝和动脉硬化、减缓糖尿病等功效［5-8］。

早老性痴呆症（又称阿尔茨海默氏病）是以包括记忆和认知功能在内的智力逐渐衰退为特征的致残性神经系统疾病。它是老年人中最常见的痴呆类型，占所有痴呆病例的50%～75%，包括智力损伤、人格变化、精神错乱，最终导致痴呆并失去理智和自理能力［9-10］。本症的发病机制原因很多，目前尚不明确，认为是一种由多种病因引起的疾病，目前人们最为广泛研究和接受的是“胆碱能缺失学说”［11-12］。乙酰胆碱酯酶是胆碱能神经纤维信号传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，主要负责在胆碱能突触释放后1毫秒内快速消除乙酰胆碱，从而可以精确控制肌肉收缩，来保证生物体内神经信号的正常传递［13-14］。乙酰胆碱酯酶抑制剂是目前研究最多，作为治疗老年性痴呆症的一线药物，并且只有6 种药物获得美国FDA 许可上市：他克林、利斯的明、多奈哌齐、加兰他敏、石杉碱甲和N-甲基-D-天冬氨酸受体阻滞剂美金刚。目前研究发现，他克林具有很强的副作用，尤其是肝脏毒性明显，其余药物也只能作用于轻度或中度早老性痴呆患者，起到减缓作用，并不能很好地进行治疗。目前，其他的抑制剂正在研发中，使用乙酰胆碱酯酶抑制剂来治疗由阿尔茨海默氏病引起的胆碱能失衡症状是一种合理的办法［15-17］。因此，以天然产物为原料，寻找具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的植物源药物成为关键。

目前，国内外对冰菜的研究主要集中在冰菜的营养价值、栽培种植以及景天酸代谢方面，冰菜作为兼性盐生植物，具有很强的耐盐性和耐旱性［18］。国外研究者常把冰菜作为景天酸代谢分子遗传研究的有用模型［19］。而对其生物活性研究较少，本研究对冰菜的乙醇提取物及其乙醇提取物萃取后的四个部分的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了研究，旨在为冰菜的有效开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冰菜样品于2018 年5 月采自中国热带农业科学院热带生物技术研究所文昌耐盐蔬菜种植基地。标本存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所B502实验室。

仪器及试剂：旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；安捷伦1260分析型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；电子计重秤（厦门佰伦斯电子科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；超纯水装置（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）；乙酰胆碱酯酶、他克林（Sigma 公司）；常用分析纯有机溶剂（广州化工和天津大茂公司）；浓硫酸（博滨岭化工有限公司）；色谱溶剂（天津四友和天津康科德公司）；其他试剂均为重蒸工业试剂。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

将冰菜（50.0 kg）用闸刀切成2～3 cm 的小段，置于塑料桶内，用食用酒精提取3 次，将3 次浸泡得到的提取液合并，用滤纸过滤掉残渣，得到冰菜提取液，之后用旋转蒸发仪经减压浓缩得到提取物浸膏（200.0 g）。将提取物用超纯水溶解，使其均匀分散成乳浊液，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，并分别经减压浓缩得到石油醚部分（96.6 g）、乙酸乙酯部分（18.0 g）、正丁醇部分（75.0 g）和水部分。

1.2.2 活性测试

采用Ellman 法［20-21］测定乙酰胆碱酯酶抑制活性，冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分均用DMSO 进行溶解，取110.0 μL 磷酸缓冲液（pH8.0）、10 μL待测样品（50.0 μg/mL）和40.0 μL 乙酰胆碱酯酶（0.02 μg/mL）于96 孔板中，30.0℃恒温20.0 min后加入DTNB（2.48 mg/mL）和碘化硫代乙酰胆碱（1.81 mg/mL）等体积混合液40.0 μL，反应体系总共200.0 μL，30.0 min后，405 nm处用酶标仪检测吸光度（A）值，阳性对照为他克林，反应终质量浓度为0.08 μg/mL，阴性对照为DMSO，终浓度为0.1%，实验重复3次，按照公式计算化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制率：

抑制率＝（E－S）/E，

式中，E为阴性对照平均A值，S为待测样品的平均A值。

1.2.3 数据处理

冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分的乙酰胆碱酯酶抑制活性数据经Excel初步计算后，所有的试验数据利用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 氏多重比较，试验结果均采用平均值±标准差的形式表示，p＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

采用Ellman 法［20-21］测定冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分的乙酰胆碱酯酶抑制活性，结果表明，以他克林为阳性对照，冰菜乙醇提取物及萃取后各部分中，除水部分无活性外，其余各部分均有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性（表1）。石油醚部分乙酰胆碱酯酶抑制率最强，为（77.72±3.30）%。乙酸乙酯部分具有一定的乙酰胆碱酶抑制活性，抑制率为（48.38±1.28）%。乙醇提取物（16.03±0.12）% 和 正 丁 醇 部 分（30.06±0.79）%对乙酰胆碱酯酶抑制活性较弱。水部分没有检测到乙酰胆碱酯酶抑制活性。石油醚部分乙酰胆碱酯酶抑制率最强，达到（77.72±3.30）%，较阳性对照组他克林的抑制活性高出4%左右，对冰菜乙醇提取物及萃取后各部分和他克林对乙酰胆碱酯酶抑制活性进行单因素方差分析并进行t检验发现，石油醚部分与阳性对照的显著性为0.013，差异达显著水平（p＜0.05），说明石油醚部分中可能含有可以抑制乙酰胆碱酯酶活性的物质，值得进一步分离。乙酸乙酯部分、乙醇提取物和正丁醇部分对乙酰胆碱酯酶抑制活性与对照组显著性均为0，差异达显著水平（p＜0.05），对乙酰胆碱酯酶抑制活性较弱。

表1 冰菜乙醇提取物及四个萃取部分的乙酰胆碱酯酶抑制活性

3 讨论与结论

随着世界人口逐渐老龄化，越来越多的人有患阿尔茨海默病的风险。据调查，2006 年，全球约2 660 万人患有阿尔茨海默病。预计到2050 年，这一数字将翻两番，超过1亿人患有该病［22-23］。目前已经批准上市的6种临床常用的乙酰胆碱酯酶抑制剂都伴随着不同程度的不良反应，例如恶心、头晕、呕吐、腹泻、唾液增多以及肌无力等症状［24］。从天然植物中提取乙酰胆碱酯酶抑制剂已成为当前研究的热点，国外研究者从多种植物中筛选出一些具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质，主要是生物碱类、萜类、天然黄酮类等化合物，其中主要用于临床治疗阿尔茨海默病的药物，其活性成分主要都为生物碱类，其余种类化合物抑制活性较低［25］。本研究发现了冰菜中可能含有具有良好乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质，特别是冰菜乙醇提取物的石油醚萃取物表现出了与阳性对照他克林相近的乙酰胆碱酯酶抑制活性，由此猜测，如果可以从冰菜乙醇粗提物的石油醚部分中分离得到对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的化合物，则该化合物有潜力发展成为一个有效的、具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的先导化合物。因此，在接下来的工作中，主要以乙酰胆碱酯酶抑制活性为导向，对冰菜乙醇提取物的石油醚萃取部分以及乙酸乙酯部分进行进一步的分离纯化，以期可以得到具有该活性的化合物。总体来说，冰菜除了具有丰富的营养价值，被用于食用外，其中含有的一系列的药理活性物质同样值得以活性为导向去分离，筛选并发掘其中具有生物活性的成分，为更好地开发与利用冰菜提供理论基础。