呼伦贝尔退化草场土壤AM真菌多样性及与土壤因子的相关性分析

寇书萌,李颂硕,肖 明

(1.上海辰山植物园，上海 201602；2.上海师范大学，上海 200234)

1 引言

草原是世界上分布范围最广的植被类型之一，是陆地生态系统的重要组成部分。我国草地面积为60亿亩，居世界第二位，占世界草地13%，占全国陆地总面积41%，是耕地的3倍，林地的4倍[1]。但由于长时间以来对草地资源的重要性认识不足，使草地资源一直存在重农轻牧、重牧轻草、重用轻管等不合理利用的问题，造成草原三化(退化、沙化、碱化)日趋严重，其中内蒙古草原退化面积占42%。为此，加强对草原生态系统退化的生物学机制研究，改善退化生态系统的生态效益、提高其生物生产力已成为目前亟待解决的重要课题。

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizae，AM )真菌能与陆地生态系统中80%以上的高等植物形成菌根结构，并对植物群落的物种组成及生态系统的稳定起着重要作用。AM真菌通过在土壤中形成菌丝桥将不同的植物物种紧密的联系在一起，而C、N、P等矿质营养可通过菌丝桥在不同植物物种间进行转移和分配。国际上一直非常重视对AM真菌的研究，更有学者指出，土壤中AM真菌的种类组成，物种丰富度的变化直接影响到植物群落的组成和结构，其多样性是影响植物多样性、植物生产力和群落稳定性的重要因素，因此研究AM真菌的多样性对生态系统的稳定有着重要的意义和作用。

本研究通过测定内蒙古草原长期放牧干扰形成的不同退化程度下土壤因子和牧草根段侵染率的变化，探究AM真菌侵染率与土壤因子的相关性。并运用PCR-DGGE技术，研究不同退化程度下土壤AM真菌多样性的变化，并尝试根据土壤因子分析引起这种变化的因素。为科学管理和合理开发利用微生物资源、恢复退化草地的生物学功能提供依据。

2 材料与方法

2.1 研究区域与样地概况

研究地位于内蒙古呼伦贝尔市陈巴尔虎旗好力堡嘎查附近，该地地处内蒙古自治区呼伦贝尔市西北部，地处呼伦贝尔大草原腹地，地理坐标为48°48′～50°12′N，118°22′～121°02′E。属中温带半干旱大陆性气候，春季气温回升快、变幅大、大风日数多，天气变化剧烈。据气象站多年观测，年平均风速为3.5 m/s，主导风向为西北、西南，大风日多发生在春、秋季，春季平均风速达5.1 m/s，每月日平均风速大于或等于8 m/s的日数为18 d左右，秋季平均风速3.8 m/s。全年降水量为300 mm；年平均温度-1.5 ℃。夏季多雨、温和、潮湿，也是降雨集中的季节，占全年降水量的71%，是牧草繁殖生长的主要季节；秋季气温开始逐渐下降、降水量明显减少，为40～45 mm，占全年降水量的15%左右；冬季漫长而严寒，降水以雪的形式出现。

研究地主要生态建群为羊草(Leymus chinensis)，土壤类型为栗钙土，草原退化成辐射状变化。根据草地利用情况和利用程度，以及草地植被的现况，依照李博提出的草地退化分级及其划分标准[2]，在植被、土壤和地形条件相对一致的地段设置了不同退化程度的研究样地，即未退化草场(No degradation, UD)，轻度退化草场(Light degradation，LD)，中度退化草场(Moderate degradation,MD)，重度退化草场(Highly degradation,HD)。图1为采样地点，表1所示为不同退化程度草场地理位置、放牧强度、植被状况。

图1 采样地点表1 不同退化程度草场的地理位置、放牧强度、植被状况(N=4)

采样地地理位置海拔/m土壤类型产草量/(kg/亩)蓄载量/(亩/头、牛)平均草高/cm植被覆盖度/%未退化草场N 48°57′4.5″E 119°26′14.1″680栗钙土6010～1244.892轻度退化草场N 48°56′30.0″E 119°25′19.0″685栗钙土4710～1539.490中度退化草场N 48°55′53.6″E 119°26′11.8″658栗钙土3530～3527.440重度退化草场N 48°54′42.0″E 119°26′40.7″655栗钙土2040～506.255

2.2 土壤样品采集与处理

2014年8月，于每个退化程度的样地按五点取样法挖取根围土层0～10 cm剖面的土壤样品及部分根系，装入塑封袋内，并分别标注UD、LD、MD、HD。带回实验室后，4 ℃保存，风干、研磨、过1 mm筛后用于土壤理化性质分析及酶活的测定，过2 mm筛后-20 ℃保存用于分子生物学分析。

2.3 测定方法

2.3.1 土壤理化性质及酶活性测定方法

土壤含水量的测定采用烘干法；土壤团聚体测定采用人工筛分法；pH值测定采用电位法；电导率采用雷磁电导率仪测定；有效磷含量采用钼锑抗比色法；总碳含量测定采用重铬酸钾容量法；总氮含量测定采用凯氏定氮法；蔗糖酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法；脲酶活性的测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；碱性磷酸酶的测定采用磷酸苯二钠比色法[3]。

2.3.2 牧草根段菌根侵染率测定方法

将牧草根系用清水冲洗干净，剪成0.5～1.0 cm的小根段放入粗试管中，加入10% KOH溶液，放在90 ℃恒温水浴锅中40 min(20～60 min，幼嫩根时间可短一点，老硬根则需较长时间)，然后用清水轻轻冲洗根段3～4遍，再加入2%的HCl溶液浸泡酸化5 min，去除酸液后，再加入0.01%的酸性品红乳酸甘油染色液，室温下过夜。再加入乳酸进行分色，于Olympus显微镜下观察测定AM真菌侵染状况[4]。

采用根断侵染加权法[5]按照公式计算样品根系菌根的侵染率：

牧草根段侵染率(%)=∑(0%×根段数+10%×根段数+20%…+100%×根段数)/观察总根段数

(1)

2.3.3 土壤DNA提取与纯化

准确称取0.5±0.05g土壤样品，通过SDS高盐裂解法提取土壤总DNA，并采用康为世纪公司的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Gel Extraction Kit CW2302)对提取的DNA进行纯化，于-20 ℃保存备用。

2.3.4 AM真菌特异性片段PCR扩增

将所得的DNA适当稀释后，作为模板进行PCR扩增。第一次PCR：引物为真菌18S rDNA 通用引物GeoA2和Geol1，反应程序为94 ℃ 4 min 预变性；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；2 ℃ 7 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测。第二次PCR：第一次PCR产物稀释100倍后作为模板进行第二次PCR扩增，所用引物为AM1和NS31-GC。反应程序为94 ℃ 2 min预变性；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行检测。第三次PCR：第二次PCR产物稀释100后作为模板进行第三次PCR扩增，所用引物为NS31-GC和Glo1。反应程序为94 ℃ 2 min预变性；94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。三次PCR扩增反应体系均为：10μL ddH2O，0.5μL BSA，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1.0μL模板和12.5μL TaqDNA聚合酶[6]。

2.3.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

将第三次PCR产物10μL用DGGE仪(北京君意电泳设备有限公司，JY-TD331A型变性梯度凝胶电泳系统)进行DGGE分析。按照制造商要求进行样品处理、电泳、银染等操作，当观察到DNA条带清晰可见时，终止显影，并拍照记录实验结果。

表2 用于AM真菌特异性片段巢式PCR扩增的

注：NS31-GC的5’端接：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG

2.3.6 数据处理与分析方法

所有数据输入Microsoft Excel 2007进行整理，后使用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和相似性分析(P<0.05)。采用凝胶分析软件Quantity-One(Bio-Rad)输出各泳道各条带的峰面积和亮度峰值，并计算物种丰富度(Species richness, S)，AM真菌多样性指数(Shannon diversity index, H)和均匀度指数(Evenness index)，采用NTsys 2.10进行聚类分析采用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)算法，并生成系统树图。物种丰富度以样品内出现的条带数来表示。微生物结构多样性用Shannon指数H来表示，H的计算是基于DGGE条带的位置和条带的强度，而条带的强度则通过条带的峰面积来表示，具体公式如下：

Shannon diversity index=H=-∑(ni/N)In(ni/N)

(2)

式(2)中ni为第i个种的亮度峰值，N为所有物种亮度峰值之总和。

均匀度指数Evenness index=H/InS。

3 结果与分析

3.1 不同退化程度草原土壤理化性质的变化特征

土壤理化性质分析(表3)表明，土壤含水量随草地退化程度的加深呈现递减趋势，各处理组间存在显著差异。土壤退化在很大程度上取决于土壤水分条件的变化，随放牧强度的提高，牲畜“蹄耕”表土并导致土壤水分含量逐步下降的效应非常明显。土壤中直径大于0.25 mm的土壤结构体被统称为土壤团聚体，它是土壤中养分和水分的“藏库”，其含量的多少，在一定程度上反映了土壤存储养分和保蓄水分的能力，其对土壤的农学价值起着主要的作用[10]。未退化草场的土壤团聚体结构数量最高，土壤结构更加黏重紧实，含水量也相对较高。随退化程度的加深，各样地土壤团聚体结构数量急剧下降，严重退化草地的土壤团聚体结构数量为7.77%，仅为未退化草地的1/5。土壤酸碱性对土壤其它性质有较大的影响，如土壤微生物的活动、土壤有机质的分解、土壤营养元素的释放与转化以及土壤发生过程中元素的迁移等都与酸碱性有关[11,12]。土壤pH值随草地退化程度的加深而上升，UD与LD间无显著差异。说明退化会导致土壤碱化，而碱性土壤不利于植被的生长。EC值用来测量土壤中可溶性盐的浓度，土壤可溶性盐浓度高会使植物受到损伤或造成植株根系的死亡。不同退化程度草原土壤EC值之间存在显著差异，并随退化程度的加剧而升高，HD、MD样地的可溶性盐含量较高，均大于1000 μs/cm。重度退化样地的海拔相对较低(UD：680 m，LD：685 m，MD：658 m，MD：655 m)，由于微地形的变化，使土壤盐分易堆积，其它矿化成分频繁改变。土壤有效磷含量是衡量土壤磷素供应状况的重要指标，它在土壤肥力诊断与施肥方面具有较大意义[13]。土壤有效磷含量在各退化程度样地之间呈现出LD>UD>MD>HD的趋势，轻度退化与未退化草地之间无显著差异。土壤全氮含量是衡量土壤氮素供应状况的重要指标[14]。总氮含量随退化程度的加深，呈现递减趋势，轻度退化与中度退化之间无显著差异。总碳含量则呈现UD>MD>LD>HD的变化趋势，且各样地间存在显著差异。

表3 不同退化程度草原土壤理化性质的变化特征 (N=4)

注：根据最小显著差异差数法(LSD)，标记相同字母表示差异不显著(P>0.05)，标记不同字母表示差异显著(P<0.05)

3.2 不同退化程度草原土壤酶活性的变化特征

土壤酶是目前公认的可以作为评价土壤质量的指标之一，其中脲酶参与土壤氮素转化，为作物生长提供氮源，蔗糖酶参与土壤碳循环[15]，碱性磷酸酶的酶促作用能够加速脱磷速度, 提高土壤磷素的有效性[16]。

不同退化程度草原土壤酶活性变化如表4所示，脲酶活性随退化程度的加深，呈现递减趋势，且各处理组间存在显著差异。各样地蔗糖酶活性和碱性磷酸酶活性则呈现出LD>UD>MD>HD的变化趋势，且各样地间存在显著差异。

表4 不同退化程度草原土壤酶活性的变化特征(N=4)

注：根据最小显著差异差数法(LSD)，标记相同字母表示差异不显著(P>0.05)，标记不同字母表示差异显著(P<0.05)

3.3 不同退化程度下牧草根段菌根侵染率的变化特征

在所有处理组中的牧草根部都发现了泡囊(Vesicle)、菌丝(Hyphae)、丛枝(Arbuscules)的结构(图2)。随退化程度加深，菌根侵染率随之下降，各样地间侵染率存在显著差异，如图3所示。

图2 牧草根段的丛枝(a)、菌丝(b)、泡囊(c)结构

3.4 AM真菌侵染率与土壤因子的相关性

由表5可知，AM真菌侵染率与土壤含水量、脲酶活性呈显著正相关，与土壤pH值、EC值呈显著负相关，说明土壤含水量直接影响AM真菌菌丝的延伸，水分含量低且高盐碱的土壤不适合AM真菌菌丝的扩散和延伸。脲酶是将酰胺态有机氮化物水解转化为植物可以直接吸收利用的无机氮化物的酶[17]，AM真菌的侵染有助于土壤氮素转化。AM真菌侵染率与土壤有效磷、总氮、总碳、蔗糖酶、碱性磷酸酶无显著相关性。

图3 牧草根段AM真菌侵染率表5 不同AM真菌侵染率与土壤因子的相关性

指标含水量pH值EC有效磷总氮总碳脲酶蔗糖酶碱性磷酸酶侵染率0.965∗-0.961∗-0.959∗0.5970.8720.7760.967∗0.7590.855

注：*表示两者之间在P<0.05水平上有显著相关性

3.5 不同退化程度草原土壤AM真菌PCR-DGGE分析

应用DGGE技术分离不同退化程度草原土壤AM真菌18S rDNA区域片段PCR产物(图4)，可以看出，不同退化程度草原土壤样品DGGE电泳条带数目、强度均有差异。根据DGGE实验原理，每条条带都代表一个AM真菌分子种。应用Quantity One (Bio-Rad)对获得的DGGE图谱进行条带分析，扣除10%的背景强度，获得图谱中条带数量。由于不同退化程度样地间植物种类组成不同，各样地AM真菌种类、优势种都存在差异。但由于本研究的样地选在天然羊草草地上，虽然各退化程度样地中植物种类有所不同，却仍然存在共有植物，因此在各样地的DGGE图谱中仍存在共同条带但亮度不同，即拥有共同的AM真菌种类，但相对多度不同。

图4 PCR-DGGE分析不同退化程度草原土壤AM真菌的多样性

3.6 聚类分析

为研究不同退化程度土壤样品AM真菌的相似性，由Dice系数按照UPGMA算法计算各泳道样品相似性的矩阵(表6)，绘出DGGE条带的系统树图(图5)。

表6 各泳道样品相似性的矩阵

图5 各泳道DGGE条带的系统树

聚类分析表明：所有土壤样品的相似性为51%，在相似性62%时可以分成二类，第一类是样品HD；第二类是样品MD、UD；MD、UD的相似性最高，达到71%；土壤样品LD与其他土壤样品的相似性最低，为51%。

3.7 AM真菌群落多样性分析

对DGGE图谱上条带峰值和条带数进行分析可知，不同退化程度草原土壤AM真菌菌种数较少，多样性指数(Shannon diversity index)和均匀性指数(Evenness index)总体较低。AM真菌多样性、丰富度、均匀度变化趋势呈现LD>UD>MD>HD。

表7 各样地AM真菌多样性指数、丰富度、均匀度

不同退化程度草地之间，轻度退化程度的AM真菌多样性高于未退化草地，似乎与一般生态演替规律相反。这可能是由于随着土壤自身生存环境的改变，土壤中大量有机残体转化，从而使土壤肥力在这一阶段内有所提高。放牧是草原最主要的利用方式，过度放牧导致土壤理化性质变差且生物活性下降，AM真菌多样性降低，适度放牧有助于土壤理化性质和生物活性的恢复，促进土壤物质的循环过程。AM真菌多样性变化符合Connell等提出的“中度干扰假说”(Intermediate disturbance hypothesis)，即中等程度的干扰使多样性维持较高水平，它允许更多的物种入侵和定居。也就是说，适度干扰可提高土壤活性，有利于退化草场的恢复(表7)。

3.8 AM真菌多样性与土壤因子相关性分析

相关性分析结果显示(表8)，AM真菌多样性指数、物种丰富度、均匀度都与有效磷、碱性磷酸酶活性呈显著正相关(P<0.05)；与蔗糖酶活性呈极显著正相关(P<0.01)；与含水量、pH值、EC值、总碳、总氮、脲酶活性虽具有一定的相关性，但并无显著关系。

在植物的土壤磷素营养中，有机磷化合物占有一定的比例，而有机磷往往要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能转化成为植物可能利用的形态。所以，土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性[18]。本研究中，AM真菌多样性指数、物种丰富度、均匀度 AM 真菌与碱性磷酸酶活性呈显著正相关(P<0.05)，说明土壤有机磷转化和利用直接影响AM真菌的生长和寄主。

蔗糖酶是能把高分子化合物分解成植物和微生物能利用的营养物的水解酶之一，为土壤生物体提供充分能源，其活性反应了土壤有机碳积累与分解转化的规律[19]。AM真菌多样性、丰富度、均匀度与蔗糖酶活性呈极显著正相关(P<0.01)，说明土壤有机碳积累与分解转化直接影响到AM真菌的生长发育与宿主代谢。

表8 不同AM真菌侵染率与土壤因子的相关性

注：*表示两者之间在P<0.05水平上有显著相关性；**表示两者之问在P<0.01水平上有极显著相关性

4 讨论

为研究草场退化程度与土壤AM真菌多样性和土壤因子的相关性，本实验在内蒙古呼伦贝尔市陈巴尔虎旗好力堡嘎查附近设置了不同退化程度的研究样地，即未退化草场(No degradation, UD)、轻度退化草场(Light degradation，LD)、中度退化草场(Moderate degradation , MD)和重度退化草场(Highly degradation , HD)，并于2014年8月采集土壤及根系样品作为实验样本进行研究。土壤的理化性质分析结果表明：土壤含水量随草地退化程度的加深呈现递减趋势，各处理组间存在显著差异；随放牧强度的增加，退化程度的加深，各样地土壤团聚体结构数量逐渐下降；土壤pH值和EC值随退化程度的加剧而升高；土壤有效磷含量在各退化程度样地之间呈现出LD>UD>MD>HD的趋势，总碳含量则呈现UD>MD>LD>HD的变化趋势，这些结果与其他一些学者的研究结果相一致，即适度放牧可以加速土壤中养分循环，但总氮含量却未显示出此种趋势，其会随退化程度的加深呈现递减趋势；土壤脲酶活性随退化程度的加深，呈现递减趋势；蔗糖酶活性和碱性磷酸酶活性则呈现出LD>UD>MD>HD的变化趋势。随草原退化程度加深，AM真菌菌根侵染率随之下降，各样地间侵染率存在显著差异。本研究采用SDS高盐裂解法从土壤样品中抽提总DNA，总DNA经试剂盒纯化后，利用巢式PCR扩增AM真菌基因片段，于扩增得到大约230bp的条带。经PCR-DGGE分析，不同退化程度草原土壤AM真菌多样性指数总体较低，AM真菌多样性指数、丰富度、均匀度变化均趋势呈现LD>UD>MD>HD的趋势。这与戎郁萍、高雪峰等人的研究结果相一致，即轻度的放牧利于土壤微生物的繁殖[20,21]。经相关性分析发现AM真菌侵染率与土壤含水量、脲酶活性呈显著正相关，与土壤pH值、EC值呈显著负相关，与土壤有效磷、总氮、总碳、蔗糖酶、碱性磷酸酶无显著相关性。AM真菌多样性指数、物种丰富度、均匀度都与有效磷、碱性磷酸酶活性呈显著正相关；与蔗糖酶活性呈极显著正相关。

在日趋严重的过牧和天然因素的综合影响下，草原退化带来严重的生态环境问题。为了草原地区的可持续发展，应当建立合理的草原利用制度，科学控制载畜量，减少过度的人为干扰；因地制宜采取围封保护或轮牧制度[22]。