运输应激对山羊血清和空肠中HSP27、HSP70和HSP90含量的影响

刘

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000）

运输应激是畜牧生产活动中不可避免的一种刺激，在多种应激源共同作用下动物生理及行为等方面会发生变化，同时生长、繁殖和免疫等功能也受到损害，影响动物生产和福利[1]。运输应激会降低肉仔鸡的肌肉品质而增加血浆皮质酮含量[2]，运输后鸽子的皮质酮等指标升高并表现出心肌和肝脏损伤[3]，随运输时间延长大鼠空肠的损伤加剧[4]，运输应激也会改变奶牛、肉牛、肉羊和猪血液生化和免疫等指标，并对心脏、肝脏或肾脏等器官产生一定损伤[5-7]。以上研究结果表明，运输应激对畜禽和实验动物的健康、生产和福利均会造成一定影响。

除了影响动物机体内环境的平衡外，应激也会使细胞内稳态发生紊乱，细胞应激时一些具有保护作用的蛋白质（如热休克蛋白和急性期反应蛋白等）新合成或合成增加，成为动物机体在细胞、蛋白质和基因水平的应激反应表现。研究表明，猪心脏和肝脏中HSP70 mRNA转录水平随运输时间增加呈上升趋势[8]；肉牛运输后肝脏、心脏、外周血淋巴细胞和肌肉中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA和蛋白表达增加[9]，运输6 h肉牛血清中HSP70浓度升高[10]。本研究旨在探讨运输应激对山羊血清和空肠中HSP27、HSP70和HSP90含量的影响，为进一步研究山羊运输应激的发病机制和防治措施提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组 在江西本地山羊养殖场选择精神状态和健康状况好、体况相近、体重为（13.89±2.96）kg且经检测布鲁菌病阴性的赣西雄性山羊12头，随机分为对照组、运输应激2 h组和运输应激6 h组。对照组正常环境下饲养不做处理，运输应激处理将山羊装载到运输车辆上，从06:00至12:00进行运输，车内温度在28～32 ，天气晴朗，车辆行驶速度为35～45 km/h，运输途中禁食禁水，分别在运输2 h（08:00）和6 h（12:00）后对运输山羊经颈静脉采集血液5 mL，静置后用低速台式离心机（TDL-60B，购自上海安亭科学仪器公司）3 000 r/min离心15 min分离血清并分装为3管，置-20 冰箱保存备用。速眠新肌肉注射麻醉，屠宰后选取空肠前段用4 PBS清洗数次后放入液氮中速冻，然后放入-80 Thermo Scientific超低温冰箱（购自江西省立康科技有限公司）中冷冻保存备用。

1.2 检测指标和方法 山羊热休克蛋白HSP27（STH180 003-96T）、HSP70（STH180004-96T）和HSP90（STH 180005-96T）酶联免疫分析试剂盒购自北京爱普锐晟科技有限公司，其中纯化的山羊热休克蛋白抗体、抗原以及HRP标记的热休克蛋白抗体均由King Bio-Medical,Inc.提供。参照ELISA试剂盒说明书应用双抗体夹心法测定12只山羊血清和空肠样本中3种热休克蛋白水平，每只山羊检测3份血清和空肠样本，按要求准备试剂、样品和标准品，设空白对照孔（不加样品和酶标试剂）、标准孔和待测样品孔，标准孔将50 μL标准品加入酶标包被板，将40 μL样品稀释液加入待测样品孔后再加入10 μL待测样品（稀释5倍），封板后37 反应30 min，弃去液体甩干，洗涤液洗板5次后加入50 μL酶标试剂，封板后37 反应30 min，弃去液体甩干，洗涤液洗板5次后依次加入50 μL显色剂A和B，震荡混匀后37 避光反应10 min，加入50 μL终止液终止反应，在450 nm波长下用美国Awareness Chromate 4300酶标读数仪在15 min内测定吸光度（OD值），以OD值为纵坐标、标准物浓度为横坐标绘制标准曲线，根据样品OD值通过标准曲线计算浓度。

1.3 统计分析 用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，采用LSD方法进行多重比较，结果用平均数±标准差表示，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表明差异极显著。

2 结 果

2.1 运输应激对山羊血清HSP27、HSP70和HSP90含量的影响 由表1可见， HSP27含量在3组间无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，运输应激2 h组和6 h组HSP70含量极显著升高（P＜0.01），HSP90含量分别较对照组极显著升高（P＜0.01）和显著升高（P＜0.05）。运输应激2 h组和6 h组间HSP70、HSP90含量无显著差异（P＞0.05）。

2.2 运输应激对山羊空肠HSP27、HSP70和HSP90含量的影响 由表2可见，运输应激6 h组HSP27含量较运输2 h组极显著降低（P＜0.01），但运输应激组与对照组差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比，运输应激2 h组HSP70和HSP90含量显著升高（P＜0.05），运输应激6 h组HSP70和HSP90含量无显著变化（P＞0.05）。运输应激6 h组HSP70和HSP90含量较2 h组极显著降低（P＜0.01）。

表1 运输应激对山羊血清HSP27、HSP70和HSP90含量的影响 pg/mL

表2 运输应激对山羊空肠HSP27、HSP70和HSP90水平的影响 pg/mL

3 讨 论

运输导致牛羊应激，一些生理和生化参数发生改变，对生产、健康和肉品质均造成不利影响。研究运输对动物生理的影响，调查相关因子在血液循环中的规律，发现应激和疾病易感性有效的生物标记，有助于早期鉴别应激敏感动物。HSPs在各种环境压力下表达增加。对于山羊，热带地区夏季山羊血清HSP70表达明显高于冬季，HSP70高表达在保护细胞免受慢性热应激中发挥作用[11]；运输后山羊心脏和肾脏HSP70表达有所升高，HSP70高表达对肌肉糖原浓度的维持有保护作用，从而影响反刍动物的肉品质[12]。对于肉鸡，运输0.5、1、2、4 h后肉鸡血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶逐渐升高，HSP70浓度运输0.5 h时变化不明显，运输1 h以上则明显升高[2]；在热应激和运输应激条件下HSP70浓度在肉鸡心脏、肝脏、肾脏和脑组织中升高，肉鸡饲养密度增加时HSP70表达水平也上升[13]。Zhang等[14]将20头猪随机分为0 （对照组）、1 、2 和4 h运输组，与对照组相比，3个运输应激组猪血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肌酸激酶同工酶明显升高，实质器官组织细胞急性损伤，以心肝急性变性为特征，运输2 h时HSP27表达水平在心脏中明显增加，运输4 h时HSP27在肝脏中增加。以上试验结果表明，动物暴露于不利条件导致HSPs家族蛋白表达增加[15]。HSP70是在哺乳动物中最重要、研究最广泛的热休克蛋白，具备一些重要的分子伴侣功能，在新合成蛋白的折叠和转运中起作用。在各种环境和氧化应激条件下细胞释放HSP70，激活各种调节蛋白而抑制凋亡，对细胞生存起关键作用，应激条件下研究HSP70在血清的表达有重要意义。已有研究表明，HSP70在应激条件下对细胞发挥一定的保护作用，如牛胚胎和不同组织在热应激和其他应激的刺激下HSP70转录增加，血液中HSP70浓度升高是慢性应激的可靠指标，可以被认为发挥细胞保护作用[16-18]。HSP90也是一种分子伴侣可以保护新合成蛋白正确构型，防止蛋白亚单位不合适的折叠和聚集[19]。本研究结果也表明，山羊运输2 h和6 h后血清中HSP70和HSP90含量都明显升高，提示山羊对运输应激在细胞水平的适应性调节与血清中HSP70和HSP90含量升高有密切联系。

肠道具有营养吸收和屏障2个主要功能。与正常猪相比，运输应激的猪小肠pH明显降低，运输后增加的循环血压导致肠道局部贫血，不充分的微环境导致肠道酸中毒，增加肠道通透性及细菌易位，致使运输后疾病发生率上升[20]。多种生理和环境应激均可诱导HSPs表达上调，HSPs在防止蛋白变性中发挥重要作用，持续的细胞应激将损伤肠道黏膜，降低黏膜屏障的保护作用，从而导致应激性溃疡形成[21]。应激促使HSP70合成，反过来抑制肠黏膜细胞的凋亡，保护肠黏膜细胞，HSP70在细胞应激和损伤时发挥重要作用，维持肠上皮细胞结构和功能[22]。有报道称，宫内生长受限（IUGR）仔猪小肠过表达HSP70抵抗应激保护上皮细胞，维持胃肠道的形态和功能，增加IUGR猪的存活率，并认为猪肠黏膜HSP70表达增加可作为一个分子标记用来判断IUGR引起的肠道损伤[23]。HSPs是肠上皮在细胞水平的一个重要防御体系，存在抗凋亡和抗氧化、抗炎、抵抗应激作用，促进肠上皮细胞生存，维持肠黏膜完整性，保护上皮细胞的正常代谢，防止肠道功能受损，维持肠道结构和功能[24]。研究表明谷氨酰胺保护肠黏膜免受损伤促进黏膜修复，这一保护作用部分由HSP70介导[25]。本试验结果表明，山羊运输2 h空肠中HSP70和HSP90含量较对照组显著升高，运输6 h与2 h相比3种蛋白含量都极显著降低，说明运输应激初期上调的HSPs对空肠细胞发挥保护性作用，但随着运输时间延长，在应激原不断刺激下，机体消耗HSPs的量不断增加。

4 结 论

本研究条件下，运输应激后山羊血清（运输2 h和6 h）和空肠（运输2 h）HSP70和HSP90含量明显升高，热休克蛋白浓度在血清和空肠的变化可能是山羊在运输应激条件下的一种适应性调节机制。