蒙脱石改性前后对3种常见霉菌毒素的吸附效果及结构表征

2019-03-19张立阳赵雪娇赵洪波张永根

中国畜牧杂志 2019年3期

张立阳，赵雪娇，刘帅，赵洪波，张永根*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学实验实习与示范中心，黑龙江哈尔滨 150030）

霉菌毒素（Mycotoxins）是霉菌产生的次级代谢产物。据联合国粮农组织（FAO）调查指出，在世界范围内超过25%的粮食作物受到霉菌毒素污染[1]。百奥明公司对世界范围内19 757份农产品样品进行检测，指出霉菌毒素在北美及包括中国在内的亚洲北部呈现出重度污染态势，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素B1（AFB1）是最为常见的霉菌毒素[2]。此外，研究发现同一真菌可产生多种有毒代谢产物，且同种有毒代谢产物也可由多种真菌产生[3]。因而，饲料中霉菌毒素联合污染及毒素间联合作用逐渐受到研究者们重视[3]。日粮中添加非营养性霉菌毒素螯合剂是一种有效降低霉菌毒素危害的方法[4-5]，且一种理想的吸附剂应该对多种霉菌毒素有效[5]，而这种吸附作用主要取决于吸附材料的微观结构以及电荷总量和电荷分布等[6]。为了提高吸附剂对霉菌毒素的吸附性能，生产中会对吸附剂进行适当的改性处理[7-8]。本试验采用季铵盐和载金属离子对蒙脱石进行改性处理，研究改性前后蒙脱石对AFB1、ZEN和DON 3种毒素的吸附能力，旨在筛选出最佳改性方法；并对蒙脱石改性前后结构进行表征，探讨改性蒙脱石的结构变化，为饲料中霉菌毒素吸附剂的制备和合理使用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料蒙脱石购自亿如科技（北京）有限公司，样品粉碎过200目筛（0.075 mm）。改性试剂包括硫酸铜（CuSO4）和硝酸锌（Zn（NO3）2·6H2O）2种供阳离子试剂以及十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十八烷基三甲基氯化铵（STAC）、十八烷基二甲基苄基氯化铵（SKC）3种季铵盐试剂。AFB1、ZEN和DON标准品以及纯品购买于Sigma，其中标准品用于标准曲线绘制，毒素纯品用于吸附试验。

1.2 吸附材料的改性

1.2.1 载铜载锌及载铜加锌改性准确称取20 g吸附材料搅拌分散至300 mL的CuSO4（0.1 mol/L）或Zn（NO3）2·6H2O（6 mmol/L）溶液中得到悬浮液，pH调整为5.0，在 65 下恒温搅拌 4～6 h，4 000×g离心 15 min得到沉淀，去离子水反复冲洗，过滤。载铜加锌样品通过完成载铜后重复载锌的步骤获得。所有样品于65 烘干，备用。

1.2.2 季铵盐改性准确称取20 g吸附材料搅拌分散至装有300 mL水的500 mL的锥形瓶中，浸泡，搅拌分散，置于80 水浴10 min，使吸附材料在浸泡液中充分溶胀后，加入8 g改性剂，80 ，200 r/min，4 h，离心，蒸馏水清洗至无Br-和Cl-离子检出，65 烘干，备用。

1.3 吸附试验取AFB1、ZEN和DON工作液，加入到含25 mg（0.5%添加量w/v，g/mL）吸附剂的离心管中，以pH 6.0的PBS缓冲液定容至5 mL，使3种毒素浓度为2.0 μg/mL。每个处理设3个重复，以未添加吸附剂的为对照管。于25 恒温振荡水浴锅中200 r/min下振荡吸附60 min。吸附结束后10 000×g离心10 min。取1 mL上清液，加入5 mL三氯甲烷中萃取，氮气吹干后，重新用1.0 mL相应流动相溶解残渣，涡旋混匀，过0.22 μm有机滤膜，高效液相色谱（HPLC）上机检测3种毒素浓度。

1.4 蒙脱石改性前后结构表征利用扫描电镜（SEM，日立场发射扫描电镜SU8010）分析、X-射线衍射（XRD，BRUKER D8 ADVANCE）分析、傅里叶红外光谱仪（FTIR，BRUKER ALPHA-T）分析、N2吸附等温曲线分析、比表面、孔径分析（BET，Micromeritics ASAP 2460）和有机元素分析（Elementar Vario III）等技术对蒙脱石原料及最佳改性处理后材料进行结构表征。

1.5 统计分析利用Excel软件整理数据，SAS 9.2软件中ANOVA程序进行方差分析，平均值的多重比较采用Duncan´s法进行。P＜0.05为差异显著标准。

2 结果

2.1 蒙脱石改性前后对3种常见霉菌毒素的吸附能力由表1可见，蒙脱石原料本身对于AFB1有较强的吸附能力，达67.88%，经6种改性处理后，蒙脱石吸附能力均显著增加（P＜0.05），且以季铵盐改性处理效果更为明显，可达98%以上。蒙脱石原料对ZEN吸附能力较低，仅为25%左右，经改性处理后吸附能力显著增加（P＜0.05）。蒙脱石原料对DON的吸附能力与ZEN相近，仅为17%左右，经改性处理后，对DON吸附能力同样显著增强（P＜0.05），但相比于AFB1和ZEN，其增加幅度最小。在所有改性处理中，蒙脱石对3种毒素的吸附能力表现出共同的特点，季铵盐改性处理效果均优于载金属离子改性，且STAC处理后蒙脱石对AFB1、ZEN、DON的吸附能力达到最大，分别为99.48%、93.62%和65.83%。因而，本试验对蒙脱石原料和STAC改性蒙脱石进行了结构表征，以探究吸附效果增强的原因。

2.2 蒙脱石原料及STAC改性后结构表征

2.2.1 扫描电镜观察蒙脱石改性前后表面形貌由图1可见，蒙脱石原料呈块状结构，叠置片层较多，无序地堆积在一起，无明显折叠现象且厚度较大，边缘不规则；经STAC改性后的蒙脱石颗粒松散，由于插层反应后层间距扩大，块状转变为光滑的多层结构。改性蒙脱石出现了更多的剥离、疏松、较平坦的片层，片层大而薄，边缘更加尖锐有许多清晰可见、凹凸不平的孔洞。

图1 蒙脱石改性前后扫描电镜结构表征图谱

表1 蒙脱石改性前后对3种常见霉菌毒素的吸附能力

2.2.2 X射线衍射分析蒙脱石改性前后结构特征由图2可知，蒙脱石原料及改性处理后X射线衍射角2θ分别为6.02°和3.62°，根据Brag公式（2dsinθ=nλ）计算层间距分别为1.45 nm和2.44 nm，表明季铵盐阳离子已成功嵌入了蒙脱石层间。观察蒙脱石与改性蒙脱石的XRD图谱发现，除了首峰位置的不同外，其余不发生变化，这种现象表明STAC基团在交换进片层间后，对蒙脱石的层间距产生影响，对晶体结构无影响。

图2 蒙脱石改性前后X射线衍射图谱

2.2.3 蒙脱石改性前后比表面、孔体积及孔径分析表2数据显示，蒙脱石经STAC改性处理后，其比表面积、孔体积及孔径均显著增大（P＜0.05），其中比表面积增大最为明显，数值约达到蒙脱石原料的5倍左右，这种变化更有助于蒙脱石吸附能力的增强。

表2 不同吸附材料改性前后表面参数

2.2.4 傅里叶红外光谱分析蒙脱石改性前后结构特征蒙脱石的特征峰（图3）：1 458 cm-1处的季铵盐的C-H弯曲振动，1 024 cm-1处的Si-O-Si伸缩振动峰，515 cm-1处的Si-O-Al弯曲振动峰，460 cm-1处的Si-O-Si弯曲振动峰。这些吸收峰在改性前后未发生显著变化，表明STAC改性对蒙脱石的晶体结构无显著影响。但改性处理后，在2 829、2 897 cm-1处出现2个较强吸收峰，是STAC改性剂中的C-H伸缩振动峰。羟基的伸缩振动区域为3 300～3 700 cm-1，通过比较STAC改性前后的红外图谱，发现在3 597 cm-1处出现的吸收峰较为尖锐且改性前后无显著变化，这是蒙脱石层间结构水的羟基伸缩振动峰。层间吸附水的羟基伸缩振动峰和弯曲振动峰分别为出现在3 401 cm-1处宽而矮的峰、1 630 cm-1处的吸收峰。这说明STAC改性剂已成功插入了蒙脱石的片层间，亲水性大大减弱，脱去了大量层间吸附水，但对层间的结构水分子无影响。

图3 蒙脱石改性前后傅里叶红外分析（FTIR）图谱

2.2.5 蒙脱石改性前后氮气等温吸附解吸曲线如图4所示，在相对压力p/p°较低的区域，吸附线平稳缓慢上升。在接近p°时，吸附线才迅速上升。并且在中等相对压力下可以观察到H3滞后环，此类滞后环的特点是p/p°在接近p°时，等温吸附曲线不会出现明显的饱和吸附平台，脱附等温线位于吸附等温线的上方。

图4 蒙脱石改性前后氮气等温吸附解吸曲线

2.2.6 蒙脱石改性前后有机元素含量分析蒙脱石改性前后的有机元素分析结果见表3。改性前，蒙脱石中不含有C、H、N元素，而改性后的蒙脱石中均检测到一定的C、H、N元素含量。STAC的分子式为C21H46NCl，3种元素含量增加的幅度与季铵盐分子中各元素原子数目的相对比数相同，说明季铵盐分子成功交换到了片层中。

3 讨论

表3 吸附材料改性前后有机元素分析 w%

3.1 蒙脱石改性前后对3种霉菌毒素的吸附能力在吸附剂与霉菌毒素的结合过程中，霉菌毒素的物理和化学性质是关键因素[9]。本试验结果显示，蒙脱石原料对3种霉菌毒素吸附能力由高到低依次为AFB1、ZEN和DON，主要是由于3种毒素分子极性不同造成。AFB1分子量为312，是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，含1个双呋喃环和1个氧杂萘邻酮，极性很强[10]。ZEN分子量为318，为含2个酚羟基的内酯，溶于水，只有在碱性环境下酯键才打开，是弱极性或双极性分子[11]。DON分子质量为296.32，化学名为3α，7α，15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物，分子极性较低。AFB1除末端的双呋喃环外，其余部分呈平面结构，更容易进入平面层间域。而呈现空间立体结构的ZEN和DON分子因空间位阻效应难以进入蒙脱石的层间域。因此，极性霉菌毒素AFB1更易被吸附剂有效吸附，而弱极性霉菌毒素ZEN和DON则难以被吸附[12]。

载铜、载锌是最常见的载金属离子改性方法，改性处理后，吸附材料的离子交换能力能够得到加强[13]，且能够产生较强的抑菌杀菌作用[14]。季铵盐改性是改性蒙脱石等吸附材料的一种主要方法。长碳链烷基季铵盐（如CTAB、STAC和SKC）是使用最多的改性剂，经处理后有机铵阳离子进入粘土晶层空间，使片层表面得到改性，晶层间距增加，片层表面被有机离子上的烷基长碳链覆盖，增加了粘土与高分子的亲和性，同时较长的烷基分子链在片层间以一定方式排列，可使层间距增加，有利于聚合物大分子插层到片层[15]。本试验结果显示，经2种改性方式处理后，蒙脱石对3种霉菌毒素的吸附能力显著增强，且又以季铵盐改性处理后脱毒能力变化幅度更高。其中，经STAC改性处理后，蒙脱石对3种霉菌毒素的吸附能力在所有材料及改性处理中最强。

3.2 蒙脱石原料及STAC改性后结构表征由蒙脱石改性前后对3种霉菌毒素的吸附能力测定结果可知，STAC处理是最佳的改性方式。对蒙脱石原料及STAC改性后结构进行表征，SEM扫描及XRD结果显示，改性处理后蒙脱石分子由块状结构变为层状结构，且层间距由原来的1.45 nm增加到2.44 nm。BET分析结果表明，STAC改性处理使蒙脱石层状结构中出现了更多孔洞，增加了比表面积，比较改性前后吸附等温线滞后环，发现下端闭合点未发生变化。改性后蒙脱石的滞后环在相对压力p/p°为低于0.4之前就几乎闭合了，说明样品的微孔孔隙很少，主要是介孔结构。这种变化更有利于霉菌毒素分子进入到蒙脱石结构中，与吸附位点发生作用[16]。

FTIR分析及有机元素分析结果表明，STAC分子中烷基长碳链成功插入蒙脱石层间，其排列方式受离子间强烈的范德华力影响，具有平卧单层、倾斜双层、假三层和超结构等模式，层间距被扩大后，能够容纳更多的霉菌毒素。并且吸附剂层间的疏水环境因表面覆盖烷基长链被改善，由疏油性变为亲油性，对有机物的吸附能力增强。陈雪刚等[17]的研究中用STAC和双十八烷基二甲基氯化铵对钠基蒙脱石改性后，水分散体系中，改性剂的添加量增大，吸附剂的层间距也会随之扩大。骆翼等[18]研究也表明，添加相同浓度季铵盐改性的蒙脱石中，双季铵盐改性的蒙脱石比单季铵盐改性的效果明显要差，是因为形成蒙脱石层间疏水性的分子较少。除了蒙脱石和改性剂的结构可以影响吸附剂改性效果外，插层反应时的时间、温度、浓度都对蒙脱石改性也有着重要影响。