碱性蛋白酶和木聚糖酶对玉米-豆粕型日粮干物质和粗蛋白质的体外酶解效果研究

2019-03-19刘芦鹏宋宇朵刘鑫鑫马文锋

中国畜牧杂志 2019年3期

刘芦鹏，张邦，田璐，宋宇朵，刘鑫鑫，马文锋

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023）

酶制剂作为一种安全无污染的活性蛋白分子，因其独特的作用效果被广泛应用于养猪生产[1]。仔猪消化系统发育不成熟，内源蛋白酶分泌不足，断奶时仔猪对营养物质的摄入方式由母乳转为植物饲粮，导致仔猪对日粮蛋白质的利用率较低，严重时引起消化功能紊乱和营养应激反应[2-3]。因此，在生产中，可以通过添加外源蛋白酶的方式提高对蛋白质的吸收利用[3]。同时，中国小麦产量较高，具备成为饲料原料的潜力，然而小麦含有大量木聚糖，木聚糖作为一种抗营养因子，可以增加肠道食糜粘性。因此，在生产中，一般通过补充木聚糖酶以降解木聚糖的抗营养作用。

目前，常用体内试验（动物生产试验）和体外酶解试验评价酶制剂的作用效果。然而，动物群体的个体差异不容易消除，在进行体内试验时需要保证相当数量的动物群体才能完成，因此难以同时评价多种酶类的作用效果；与体内试验法相比，采用透析袋体外酶解法，可以模拟动物胃肠道消化吸收的生理特点，该法快速、准确且重复性高[4]。本试验在玉米-豆粕型日粮中添加不同浓度的碱性蛋白酶和木聚糖酶，研究其对日粮中干物质和粗蛋白质酶解效率以及还原糖生成量的影响，为碱性蛋白酶和木聚糖酶的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 酶制剂试验所用碱性蛋白酶（活性200 000 U/g）和木聚糖酶（活性100 000 U/g）均为单酶，购自河南仰韶生化工程有限公司。

1.2 试验设计及试验日粮采用单因子试验设计，分别设置1个对照组和5个浓度梯度，每个添加水平分别设5个重复，其中碱性蛋白酶的浓度为20、40、60、80、100 U/g，木聚糖酶的浓度为10、20、30、40、50 U/g，对照组的试验程序与试验组相同。

试验原料组成参考仔猪常用日粮配制，原料组成及营养成分见表1。利用粉碎机对混合后的饲料粉碎，至95%以上过60目筛网，置于包装袋内密封，备用。

1.3 胰蛋白酶溶液称取磷酸二氢钾6.8 g，加入500 mL蒸馏水使其充分溶解，再用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，取胰蛋白酶10 g（Sigma，P7545），加入适量蒸馏水使其溶解，将2种溶液混合后，加蒸馏水定容至1 000 mL，现配现用。

表1 试验原料组成和营养成分

1.4 体外酶解操作过程模拟胃的消化：称取1 g饲料样品（精确至0.000 1 g），编号后置于150 mL 三角瓶中，加入20 mL 盐酸氯化钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 2.0）和0.1 g的胃蛋白酶（Sigma，P7000），用封口膜封紧瓶口。在厌氧条件下，将三角瓶置于39 恒温摇床内振荡6 h，震荡频率为70 r/min。

模拟小肠酶解过程：完成胃期模拟消化后，打开封口膜，加入20 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）和2.5 mL配制好的胰蛋白酶溶液。在溶液pH为7.0、厌氧环境下，封好三角瓶的瓶口，放置于39 的恒温摇床内震荡24 h，震荡频率为70 r/min。

还原糖生成量的测定：24 h后取出，取出三角瓶，室温静置20 min，取酶解后上清液1 mL于试管中，加入DNS检测液2 mL，水浴锅内煮沸5 min，取出，冷却至室温，加9 mL蒸馏水，混匀。在540 nm光波处测定各溶液的吸光度值，通过还原糖标准曲线，计算上清液中的还原糖含量。还原糖生成量计算公式：

还原糖生成量（mg/g）=（C×VT）/（m×VS）×1000其中，C为标准曲线所查糖量（mg），VT为提取液的体积（mL），m为样品的质量（g），VS为测定时的溶液体积（mL）。

干物质和粗蛋白质酶解效率的测定：使用绝干称重的滤纸对三角瓶中的酶解残渣真空抽滤，将抽滤后的残渣和滤纸置于105 烘箱中烘干至恒重，使用半自动定氮仪测定粗蛋白质含量。干物质和粗蛋白质酶解率的计算公式：

其中，M0为饲料样品干物质重量（g），M1为未酶解残渣干物质重量（g），CP0为饲料样品粗蛋白质含量（%），CP1为未酶解残渣粗蛋白质含量（%）。

1.5 统计分析以试验重复为单位，采用SAS（2001）中GLM模型进行数据分析，通过线性（Linear）和二次（Quadratic）效应评估不同浓度碱性蛋白酶和木聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白质酶解效率的影响，处理间显著性判定水平为P＜0.05，数据以最小二乘均值表示。

2 结果与分析

2.1 添加碱性蛋白酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白质酶解效率的影响由表2可知，日粮中添加碱性蛋白酶可以显著提高还原糖生成量（二次，P＜0.05）和干物质酶解效率（二次，P＜0.05）。当碱性蛋白酶添加量为60 U/g时，日粮中的还原糖生成量最高；当碱性蛋白酶添加量为80 U/g时，干物质酶解效率最高。

根据体外酶解试验结果建立还原糖和干物质酶解率（Y）与碱性蛋白酶的添加浓度（X）的回归方程。根据干物质酶解率的二次方程Y=-0.001X²+0.13X+26.99（R²=0.87，P=0.01）得出：当蛋白酶的添加量为65 U/g时，日粮中干物质酶解率最高，为31.22%；根据还原糖的生成量的二次方程 Y=-0.005X²+0.52X+32.88（R²=0.79，P=0.001）得出：当蛋白酶添加量为52 U/g时，日粮中还原糖生成量最高，为46.4 mg/g。

2.2 添加木聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白质酶解率的影响由表3可知，日粮添加木聚糖酶可以显著提高干物质酶解率（二次，P＜0.05），但对还原糖生成量和粗蛋白质酶解率无显著影响。当木聚糖酶添加量为20 U/g时，日粮中的干物质酶解率最高。

表2 碱性蛋白酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白质酶解率的影响

表3 木聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白质酶解率的影响

根据体外酶解试验结果建立干物质酶解率（Y）与木聚糖酶添加量（X）的回归方程。根据干物质酶解率的二次方程 Y=-0.006X²+0.40X+59.62（R²=0.72，P=0.002）得出：当木聚糖酶添加量为33 U /g时，日粮中干物质酶解率最高，为66.29%。

3 讨论

本试验选用的蛋白酶为碱性蛋白酶，由于其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，它由一条多肽链构成，最适pH在9～11，其在pH 6～10比较稳定，pH低于6或大于11时很快失活。目前，利用基因工程手段定向改造蛋白酶已成为研究热点[5]。研究发现，碱性蛋白酶不仅可以去除一些抗营养因子[6]，同时可以补充幼龄动物内源酶，因此作为饲料添加剂应用于养猪生产中。本试验选用的蛋白酶主要通过芽胞杆菌液态发酵获得，在生产过程中保留了少量的纤维素酶和半纤维素酶活性，因此本试验中蛋白酶不仅可以提高日粮的干物质酶解效率，也提高了还原糖生成量，表明添加蛋白酶可以在一定程度上提高营养物质利用率。

含小麦、稻谷和麸皮等饲料中的木聚糖含量较高，其降解需要木聚糖水解酶协同完成，其中木聚糖酶是最为关键的水解酶[7]。添加木聚糖酶可以有效释放细胞成分、降解木聚糖为小分子糖、降低动物肠道内容物的粘性、提高营养成分的消化率。叶楠等[8]研究发现，添加木聚糖酶可以改善断奶仔猪的生长性能，还可以改善肠道微生态环境，其作用效果与饲粮中木聚糖含量存在剂量关系。胡向东等[9]研究发现，当小麦在日粮中的添加比例达到40%时会对生长猪的生长性能产生负面影响，而在此基础上添加200 U/kg木聚糖酶后，生长猪的平均日增重和饲料增重明显改善，同时调节生长猪肠道菌群，降低氮的排放。本试验结果表明，添加木聚糖酶可以提高还原糖生成量，说明木聚糖酶的添加可以释放含小麦日粮中一定数量的单糖，因此具有潜在的营养价值。

在进行饲用酶评估时，由于体内试验的复杂性，在面对饲用酶相互筛选与配伍时，不仅工作量较大，也存在很高的变异系数。近年来，体外模拟酶解法得到普及和应用，为快速、高效评价酶制剂提供了新思路[10]。体外模拟酶解法可以建立以“三角瓶+胃肠pH+摇床”为基础的反应手段，设置对照饲粮组和酶制剂+饲粮组，此方法可以直接反映酶制剂对不同底物的酶解效果。也有研究认为，在进行体外酶解评价时，可以分别设置胃蛋白酶和胰蛋白酶的“两步法”试验程序，此方法可以更加合理地模拟动物体内酶解状态[10]。因此，本试验的对照组和试验组均采用“两步法”体外酶解程序进行研究，旨在研究在胃蛋白酶（模拟胃的酶解）和胰蛋白酶（模拟小肠酶解）的基础上添加外源酶制剂对饲粮营养物质利用率进一步的改善效率。

目前，相关试验已研究外源补充酶制剂对日粮营养组分的影响[11-13]。Bedford等[14]采用胃蛋白酶-胰液素体外两步法，发现木聚糖酶的添加剂量与食糜粘度存在较好的相关性；高理想等[15]通过体外酶解法筛选出了纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果胶酶在生猪不同日粮类型的最佳酶谱，优化后的酶谱分别使玉米-豆粕型和玉米-杂粕型日粮的体外干物质酶解率提高了3.26%和3.75%，显示酶制剂的作用效果与日粮底物关系密切。然而，体外试验毕竟不能完全模拟动物复杂的体内环境，酶制剂的作用效果也会受到动物种类及生长阶段的影响[16]，如何优化体外试验方法，使其更加贴近动物的实际消化特点，相关技术参数有必要进一步研究。