绵羊TSHR基因多态性及其与繁殖性状关联分析

寸静宇，刘秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，张效生，张金龙，赵永聚，储明星*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.西南大学动物科技学院，重庆 400715；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

哺乳动物的季节性繁殖受下丘脑-垂体-性腺轴（HPGA）的反馈调节，促甲状腺激素（TSH）和促甲状腺激素受体（TSHR）作为HPGA轴上的激素，在其逆向通路中发挥着重要作用[1]。TSH是一类糖蛋白激素，主要由垂体前叶分泌，其分泌受光照影响，从而表现出明显的昼夜节律变化[2]。TSH通过与TSHR特异性结合后行使生物学功能，功能之一就是调控哺乳动物的季节性繁殖过程[3]。TSH、TSHR通过诱导下丘脑2型脱碘酶基因（TypeⅡIodothyronine Deiodinase Gene，DIO2）和3型脱碘酶基因（Type Ⅲ Iodothyronine Deiodinase Gene，DIO3）的表达来调控甲状腺激素（T2、T3、T4、rT3等）的动态平衡，进而调控GnRH（Gonadotropin Releasing Hormone）基因表达，最终影响绵羊的产羔能力[4]。因此，国内外学者对TSHR基因与哺乳动物季节性繁殖的关系进行了大量研究。全基因组重测序是目前功能基因挖掘最主要的方式之一[5-8]。国外研究者使用该方法在鸡[4,9]和绵羊[10-11]中检测到TSHR基因与季节性繁殖调控有重要关系。

另外，国内外学者对TSHR基因的多态性分析主要集中于与动物季节性繁殖性状关联[12-15]，尚未出现关于TSHR基因多态性与羊产羔性状相关联的报道。本实验室猜测，TSHR基因除了调控季节性繁殖，还可以调控绵羊的产羔性状。鉴于此，本实验室前期通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序[7]，筛选出与小尾寒羊产羔数相关的候选基因TSHR3个多态位点g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G，并使用Sequenom MassARRAY®SNP分型技术对这3个SNPs进行检测，以探讨TSHR基因多态性与绵羊季节性繁殖的相关性，同时找到其与绵羊产羔之间的关系，为绵羊多羔性状的机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验样品 共采集760只羊的血液，其中有产羔数记录的小尾寒羊380只，没有产羔数记录的380只。无产羔记录的包括多羔且常年发情的小尾寒羊（27只）、策勒黑羊（48只）、湖羊（101只），单羔且季节性发情的滩羊（22只）、苏尼特羊（21只）和草原型藏羊（161只）。

1.2 血液DNA的提取 实验绵羊血液样本DNA提取使用血液DNA试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行，采用Nano Drop2000检测DNA样本浓度，应用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 基因分型 采用 Sequenom MassARRAY®SNP 分型技术对TSHR基因 g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位点进行分型检测，分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA浓度为40～80 ng/μL。

1.4 统计分析 应用Microsoft Excel 2016软件统计绵羊TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.894 31097C＞G位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并进行Hardy-Weinberg平衡检验。使用最小二乘方差分析模型：

其中，yijkl为产羔数的记录值，μ为群体平均值，LSi为第i个产羔季节的固定效应，Pj为第j个胎次的固定效应，Gk为TSHR基因第k种基因型的固定效应，eijkl为随机残差效应。用SPSS 19.0软件程序中一般线性模型完成小尾寒羊基因型与产羔表型数据关联分析，所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1TSHR基因多态性分析 分型发现TSHR基因g.89430525G＞A位点在小尾寒羊中有AA、AG和GG 3种基因型；g.89363881T＞C位点有TT、CT和CC 3种基因型； g.89431097C＞G位点有CC、CG和GG 3种基因型。

从表1可知，TSHR基因g.89430525G＞A、g.8936 3881T＞C和g.89431097C＞G位点基因型频率和等位基因频率在常年发情、季节性发情品种间差异极显著（P＜0.01）。就g.89430525G＞A位点而言，AA基因型为常年发情品种中的优势基因型，A为优势等位基因；就g.89363881T＞C位点而言，常年发情品种中TT为优势基因型，T为优势等位基因；就g.89431097C＞G位点而言，常年发情品种中GG为优势基因型。

从表2可知，TSHR基因g.89430525G＞A和g.893 63881T＞C位点在策勒黑羊、g.89430525G＞A位点在小尾寒羊、g.89363881T＞C位点在滩羊、g.89431097C＞G位点在小尾寒羊和策勒黑羊中表现为低度多态，这3个位点在其他品种中均表现为中度多态。卡方适合性检验结果表明，除了小尾寒羊在g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位点中处于哈代温伯格不平衡状态外（P＜0.05），这3个位点在其余品种中均处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。

2.2TSHR基因多态与绵羊产羔性状的关联分析 由表3可知，TSHR基因g.89431097C＞G的多态性与小尾寒羊第1～3胎的产羔数显著相关（P＜0.05），其中CC型母羊的产羔数显著低于CG和GG型母羊（P＜0.05）。而g.89363881T＞C和g.89430525G＞A的多态性与小尾寒羊各胎产羔数均无显著相关（P＞0.05）。

表1 TSHR基因不同SNP位点在常年发情、季节性发情绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率

3 讨 论

3.1TSHR基因与畜禽季节性繁殖之间的关系 本实验室前期通过全基因组重测序[6]，筛选出与绵羊季节性繁殖性状密切相关的TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363881T＞C 和 g.89431097C＞G 3个 位 点， 对 这3个位点的多态性进行分析发现，TSHR基因g.894 30525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位点在绝大多数的绵羊品种中有较强的选择潜力，而在策勒黑羊中选择潜力较低，说明这些位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特羊、滩羊和草原型藏羊6个绵羊群体中的变异程度存在一定差异，可能是由于策勒黑羊品种遗传多样性相对贫乏，也可能与所选择的策勒黑羊样本量不同有关。本实验中，TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位点基因型频率和等位基因频率在常年发情（小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊）与季节性发情（苏尼特羊、滩羊和草原型藏羊）绵羊品种间差异极显著，说明这3个位点与绵羊季节性繁殖性状有较强的关联。通过全基因组重测序发现，TSHR作为鸡和绵羊季节性繁殖性状候选基因受到强烈的选择[4,9-11]，说明深入研究TSHR基因的功能有重要意义，与本研究的结果趋势一致。这3个位点都在草原型藏羊和苏尼特羊中遗传变异较大，说明在这2个季节性繁殖品种中选育有望获得较大的进展。另外，除了小尾寒羊在g.89430525G＞A、g.89363881T＞C和g.89431097C＞G位点中处于哈代温伯格不平衡状态外，这3个位点在其余品种中均处于哈代温伯格平衡状态，表明经过长期的选择和进化，这3个位点在适应性方面具有一定的遗传优势。以上结果说明，TSHR基因的这3个SNP位点可能与常年发情、季节性繁殖性状密切相关。不同的常年发情绵羊品种和季节性繁殖绵羊品种在这些位点的基因型频率和等位基因频率基本趋于一致，提示TSHR基因可能在绵羊季节性繁殖性状的调控中起到至关重要的作用。

表2 TSHR基因不同SNP位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

表3 TSHR基因不同位点各基因型小尾寒羊产羔数最小二乘均值及标准误

3.2TSHR基因与绵羊产羔数之间的关系 本研究发现，TSHR基因g.89431097C＞G的多态性与小尾寒羊第1～3胎的产羔数呈显著相关，而g.89363881T＞C和g.89430525G＞A的多态性与小尾寒羊各胎产羔数均无显著相关。目前尚没有关于绵羊TSHR基因多态与其产羔性状相关联的研究报道，今后将围绕该基因开展进一步的实验研究，为验证这一假说和揭示绵羊产羔性状机理提供更多的直接证据。

4 结 论

本研究发现，TSHR基因g.89430525G＞A、g.89363 881T＞C和g.89431097C＞G位点与绵羊季节性繁殖性状具有较强的相关性，且TSHR基因g.89431097C＞G突变中CC型小尾寒羊母羊的产羔数显著低于CG和GG型母羊。因此，TSHR基因可能是影响小尾寒羊产羔数的一个重要候选基因，对绵羊繁殖性状选育具有一定的指导意义。