6-姜辣素对黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

李利萍，赖劲东，黄艳，林新瑜

（1.西南医科大学附属医院 皮肤科，四川 泸州 646000；2.遂宁市第一人民医院 皮肤科，四川 遂宁 629000）

黑色素瘤是常见性皮肤恶性肿瘤，世界范围内男性第5大恶性肿瘤，女性第6大恶性肿瘤，且近年来发病率逐年升高[1]。黑色素瘤早期症状隐匿导致其早期诊断率低，一旦确诊多属于晚期，导致黑色素瘤死亡率持续偏高[2]，目前黑色素瘤的治疗主要以手术切除为主，辅助放疗及化疗[3]。最新研究发现中药在肿瘤治疗中起到重要作用，如丹参、川芎或姜黄素等，研究中药对黑色素瘤治疗对提高肿瘤预后提供新的思路。

生姜在亚洲国家中被广泛食用，6-姜辣素是生姜提取物中的主要活性成分，其在抗氧化应激、抗肿瘤、抗炎等方面发挥重要功能[4]。既往研究发现6-姜辣素通过促进前列腺癌[5]、肾癌[6]和宫颈癌[7]等细胞凋亡发挥抗癌效果，然而6-姜辣素对黑色素瘤增殖和凋亡的影响尚未报道。内质网是细胞内重要的细胞器，各种生理或病理条件下内质网功能受损会引起细胞内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs），长期过强内质网应激会诱导细胞凋亡的发生[8]。本研究旨在探究6-姜辣素对黑色素瘤增殖和凋亡的影响，探究其是否通过调节内质网应激发挥抗肿瘤功能的分子机制，为肿瘤治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人黑色素瘤细胞系M14和A375购自中国科学院上海细胞生物学研究所，RPMI 1640培养基和DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，6-姜辣素购自美国Sigma-Aldrich公司，Annexin V-FITC/碘化丙啶双标记细胞凋亡检测试剂盒购于广州达博生物科技有限公司，半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）/活化型半胱天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly（ADP-ribose） polymerase,PARP]/活化型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[cleaved-poly（ADP-ribose）polymerase,Cleaved-PARP]抗体购自美国 CST 公司，免疫球蛋白结合蛋白（binding immunoglobulin protein,BIP）、肌醇激酶 1（inositol-requiring enzyme-1,IRE1）和氨基末端激酶（jun N-terminal kinase,JNK）抗体购自美国Abcam公司，β-actin抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2 细胞培养及shRNA转染

黑色素瘤细胞使用含10%胎牛血清RMPI 1640或DMEM培养基进行培养，培养基内加入100 μg/ml青霉素（Sigma,USA）和链霉素（Sigma,USA），置于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱，每隔2～3天对细胞进行换液，细胞贴壁达到80%时使用0.25%胰酶消化离心进行传代。M14和A375细胞接种于6孔板中待细胞生长至60%～70%，转染前用PBS清洗细胞，按转染试剂说明书将无血清培养基、shRNA基因敲减质粒或对照组Control shRNA及转染试剂混合静置15 min后转染M14细胞24或48 h，检测转染效果。

1.3 甲基噻唑基四唑法检测细胞增殖能力

取对数生长期的黑色素瘤细胞系M14和A375，按5 000个/孔接种于96孔板，细胞贴壁生长后加入不同浓度（0、10、20、40、60和80 μmol/L）6-姜辣素进行药物处理，每种浓度药物设5个复孔，重新放置于 37℃、5% CO2培养箱培养 24 h。吸去上清液加入含10%甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）的培养基 200μl继续培养 4 h，吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO并置于微量振荡器振荡10 min，使用酶联免疫检测仪在490 nm处检测吸光度（A）值，做出细胞生长曲线。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

M14和A375细胞接种于6孔板，调整细胞密度接种10×104个/孔培养至贴壁，加入60和40 μmol/L的6-姜辣素分别处理M14和A375细胞24 h，胰酶消化离心并收集细胞，使用800 r/min离心5 min并用PBS清洗2次，加入250 μl结合缓冲液并通过细胞计数获得细胞浓度，并调整浓度为1×106个/ml，吸取100 μl调整浓度后细胞悬液加入5 ml流式管内，分别加入 5 μl Annexin V-FITC（150 mg/L）和 10 μl碘化丙锭（120 mg/L）并充分混匀，放置于室温条件下进行避光孵育15 min，孵育后的悬液中加入PBS清洗细胞，洗涤后的细胞使用流式细胞仪（FACS）分析细胞凋亡率。

1.5 Western blotting检测蛋白表达

M14和A375细胞常规培养，使用胰酶消化离心并传代接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至60%～70%时加入不同浓度6-姜辣素进行处理24 h，取出并用PBS清洗3遍，加入细胞裂解液提取蛋白，4℃、15 000 r/min 离心 15 min，取 5 μl上清液使用 BCA 法测定蛋白浓度，其余加入6×Loading buffer（1∶5体积比）后在沸水中煮沸5 min变性。取30 μg所提蛋白使用SDS-PAGE凝胶进行分离和转膜，PVDF膜使用5%脱脂牛奶常温封闭1 h，加入目的抗体置于4℃冰箱的摇床上过夜孵育。TBST洗膜液洗膜10 min×3次，加入二抗置于常温摇床进行孵育1 h。TBST洗膜液洗膜10 min×3次，使用ECL显影液进行显影。目的蛋白表达量通过与内参蛋白β-actin标准化后得到相对比值。

1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测相关mRNA表达

M14和A375细胞常规培养，使用胰酶消化并传代细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至60%～70%时使用飞捷RNAfast 200提取RNA，方法参照试剂说明书进行操作。使用TaKaRa Prime ScriptTMRT Master Mix RNA 逆转录试剂盒获得 cDNA 模板，逆转录体系参照试剂说明书。使用TaKaRa SYBR ®Primix Ex TaqTMⅡ反应体系检测 mRNA 表达检测。引物序列：IRE1，正向5'-CACAGTGACGCTTCCTGAA AC-3'，反向5'-GCCATCATTAGGATCTGGGAGA-3'。应用β-actin作为内参，正向5'-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3'，反向 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表达水平采用2-△△Ct计算方法进行分析。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差分析的两两比较采用SNK-q检验；两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6-姜辣素抑制黑色素瘤细胞增殖能力

体外使用不同浓度6-姜辣素处理M14和A375细胞，不同浓度组间细胞存活率，差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组比较，6-姜辣素抑制M14和A375细胞增殖且呈浓度依赖性，测得对M14和A375细胞半数抑制浓度（IC50）分别为46.070和33.152μmol/L，根据IC50浓度选择分别选择40/60和20/40μmol/L浓度进行后续实验。见附表。

附表 黑色素瘤M14和A375细胞存活率比较 （%，±s）

附表 黑色素瘤M14和A375细胞存活率比较 （%，±s）

注：†与对照组比较，P＜0.05

细胞 0μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 40μmol/L 60μmol/L 80μmol/L F 值 P值M14 细胞 100.000±11.528 93.367±10.382 75.263±4.516† 60.085±14.284† 42.286±8.183† 20.000±12.415† 43.970 0.000 A375细胞 100.000±4.855 86.752±5.931 60.349±6.584† 40.174±4.85† 31.671±9.745† 20.000±6.854† 102.610 0.000

2.2 6-姜辣素对黑色素瘤细胞凋亡的影响

与0μmol/L组比较，6-姜辣素上调M14细胞（见图1A）和A375细胞（见图1B）Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP蛋白水平。

6-姜辣素60μmol/L处理M14细胞24h后细胞凋亡率为（28.88±2.24）%（早期+晚期凋亡率）（见图2A、2B），与 0μmol/L组凋亡率（6.72±1.27）%比较，差异有统计学意义（t=38.504，P =0.000）。6-姜辣素40μmol/L处理A375细胞24h，细胞凋亡率为（34.01±3.17）%（早期+晚期凋亡率）（见图2C、2D），与0μmol/L组凋亡率（7.97±1.69）%比较，差异有统计学意义（t=32.417，P =0.000）。

2.3 6-姜辣素对黑色素瘤细胞内质网应激的影响

M14（见图3A）和A375（见图3B）细胞BIP、IRE1和JNK蛋白表达上调。

2.4 6-姜辣素对IRE1/JNK信号通路的影响

Western blotting（见图4A） 和 qRT-PCR（ 见图4B）结果显示IRE1被基因敲减。6-姜辣素处理IRE1基因敲减细胞，MTT结果表明IRE1基因敲减后6-姜辣素抑制增殖能力减弱（见图4C），差异有统计学意义（t=2.133，P =0.039）；Western blotting检测结果显示，IRE1基因敲减后合用6-姜辣素Cleaved-Caspase-3表达减少（见图4D）。

图1 6-姜辣素对凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP表达的影响

图2 6-姜辣素对黑色素瘤细胞凋亡的影响

图3 6-姜辣素对内质网应激相关蛋白BIP、IRE1和JNK表达的影响

图4 6-姜辣素对IRE1/JNK信号通路的影响

3 讨论

恶性黑色素瘤在临床较为常见的皮肤黏膜和色素膜恶性肿瘤，具有进展快、预后差和病死率高等特点，黑色素瘤对放疗和化疗不敏感，导致其治疗效果不佳。因此选择有效性治疗恶性黑色素瘤的药物对于提高其预后显得尤为关键。

6-姜辣素是从生姜中提取的最具生物活性部分，既往文献发现6-姜辣素抑制乳腺癌细胞侵袭迁移[9]，此外其在肾癌、前列腺癌和宫颈癌等疾病中通过促进凋亡发挥抗癌效果。本研究发现它能抑制黑色素瘤增殖，并呈浓度依赖性和时间依赖性。同时发现6-姜辣素上调细胞内Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP蛋白表达水平，表明其促进黑色素瘤细胞凋亡的发生。同时本实验中使用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测6-姜辣素对凋亡的影响，发现其促进黑色素瘤细胞凋亡的发生。

内质网（endoplasmic reticulum,ER）作为细胞内细胞器主要介导蛋白质的合成、折叠、成熟与分泌。多种生理或病理条件如蛋白质糖基化的抑制、缺氧、饥饿、钙离子流失等会导致细胞内未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网内聚集，导致内质网功能受损而不能发挥正常生理功能，该现象被称为ERs[10]。内质网为恢复细胞正常功能，会通过激活内质网内未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）来保护细胞免受 ERs所引起的损伤。UPR是通过内质网分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein 78,GRP78）/BIP以及3个应激感受蛋白来介导[11]。当ERs不存在时，3个应激感受蛋白会与分子伴侣GRP78/BIP结合处于失活状态；当ERs存在时，分子伴侣GRP78/BIP与3个应激感受蛋白解离从而启动UPR反应保护细胞正常功能。IRE1是介导ERs信号通路的重要转导蛋白之一，当ERs长期存在不能缓解时，会导致细胞凋亡的发生[12]，其中IRE1会通过激活下游JNK信号通路引起细胞凋亡[8]。本研究中显示，6-姜辣素处理后细胞BIP、IRE1和JNK蛋白表达水平上调，表明6-姜辣素引起黑色素瘤细胞内质网应激的发生。并发现IRE1基因高敲减后6-姜辣素的促凋亡作用减弱，验证6-姜辣素可通过IRE1/JNK信号通路发挥功能。

综上所述，6-姜辣素抑制黑色素瘤细胞增殖并促进其凋亡发生，激活IRE1/JNK内质网应激信号通路是其可能的分子机制，进一步深入探讨6-姜辣素治疗黑色素瘤的分子机制，将有可能为黑色素瘤的综合治疗带来新的选择。