补肾壮骨方对去卵巢大鼠骨结构和骨代谢作用的研究

陈贝贝 郭鱼波 刘海霞 朱如愿 柳辰玥 贾强强 高思华 张东伟

北京中医药大学中医学院糖尿病研究中心，北京 100029

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量降低，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，骨折风险增高为特征的骨代谢性疾病[1]。随着人口老龄化的加速，骨质疏松症发病率逐年增高，已成为人类第三大常发慢性病。最新研究显示，我国骨质疏松症患病率为13%。估计到2050年，我国骨质疏松症的患者将达到2.12亿[2]。目前，市场上治疗骨质疏松的西药虽能在一定程度上抑制骨量的丢失，缓解腰痛等临床症状，但是大多数药物存在不同程度的不良反应[3]。中药以其多靶点、安全性高、不良反应少的特点逐渐成为国内外研究的热点[4]。

中医认为，骨质疏松症属于“骨痹、骨痿、骨枯”的范畴，其病因病机主要在于肾虚与血瘀，临床治则多以补肝肾和活血化瘀为主[5]。补肾壮骨方是临床上常用的经验方，由丹参、淫羊藿等组成，初步临床观察发现，该方能明显提高骨质疏松患者的骨密度(bone mineral density，BMD)、降低骨折发生率，但是其详细的作用机理尚未清楚。因此，本研究拟以去卵巢大鼠为研究对象，观察补肾壮骨方对血清学指标、骨密度、骨微结构和病理结构的影响，探讨补肾壮骨方对去卵巢大鼠骨结构和骨代谢的作用和可能的作用机制。

输水建筑物震损检查信息包括进口段、启闭设备、闸门、管道、出口段、电器以及启闭机房等。坝体内穿坝输水建筑物与坝体接触安全性是震后检查的重要内容，检查其断裂、渗漏、接触冲刷及渗水浑浊程度等情况。安全泄洪洞震损检查包括进口段、闸门、洞室以及出口段等部位。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物和试剂。补肾壮骨方由丹参、淫羊藿等药物组成，所有饮片均购自北京同仁堂，经北京中医药大学中医药博物馆马泽新教授鉴定为正品。按临床常用方法，制成水提液，浓缩成终浓度为1.4 g(含药量)/mL， 4 ℃储存备用，使用前蒸馏水稀释灌胃。

钙(Ca)测定试剂盒、磷(P)测定试剂盒、肌酐(Cr)测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein，HDL)测定试剂盒、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)测定试剂盒、总胆固醇(total cholesterol，TC)测定试剂盒、甘油三酯(triglyceride，TG)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Elisa试剂盒包括检测I 型胶原氨基端前肽(procollagen I N-terminal propeptide，PINP)、I 型胶原羧基端肽(collagen I carboxyl terminal peptide，CTX-I)、尿脱氧吡啶啉(deoxypyridine，DPD)和骨钙素(osteocalcin，OCN)均购自Cusabio BIO-Technology Co., Ltd.)，Cathepsin K 抗体(H-130，sc-28867，Santa Cruz，美国)。

模型组(OVX)大鼠骨组织微结构破坏严重，与假手术组(SHAM)大鼠相比，其BV/TV、BS/BV、Tb.N、Conn.D显著降低(P<0.05或0.01)，Tb.Sp、SMI显著增加(P<0.05或0.01)。与模型组(OVX)大鼠相比，去卵巢大鼠经过阿仑膦酸钠治疗12周后，其BS/BV、Conn.D显著增加(P<0.05或0.01)，Tb.Sp、SMI显著降低(P<0.05或0.01)。补肾壮骨方水提液高剂量(SG)和低剂量(SD)治疗的去卵巢大鼠，其BS/BV、Conn.D显著增加(P<0.05或0.01)。同时，补肾健骨方低剂量(SD)能显著增加BV/TV和Tb.N，降低SMI、Tb.Sp(P<0.05或0.01)。这说明补肾壮骨方对于去卵巢大鼠股骨的骨密度和骨微结构具有一定程度的保护作用，同时其低剂量治疗效果相对较好。

“十二五”期末，全国原煤入选能力超过26亿t，原煤入选量25.4亿t，入洗比例达到65%以上；新建选煤厂180处，能力约8.5亿t。

1.2 方法

1.2.1去卵巢大鼠模型的建立。雌性大鼠适应性饲养一周后，参照郭鱼波等[6]提供的方法进行。简述如下：大鼠用1%戊巴比妥钠(4 mL/kg)腹腔麻醉，摘除两侧子宫角末端粉红色菜花样卵巢。假手术组大鼠仅切除两侧卵巢附近等体积的脂肪组织，然后所有大鼠适应性饲养一周。

1.3 检测指标

大鼠股骨生物力学实验结果见表4。由表4可知，与假手术组(SHAM)相比，模型组(OVX)大鼠股骨最大载荷、弹性模量、最大应力明显降低(P<0.05或0.01)。与模型组(OVX)大鼠相比，阿伦膦酸钠组大鼠股骨的最大载荷、弹性模量、最大应力明显增加(P<0.05)。去卵巢大鼠给予补肾壮骨方治疗12周后，与模型组(OVX)大鼠相比，补肾壮骨方水煎液低剂量组(SD)、高剂量组(SG)大鼠股骨的最大载荷、弯曲强度显著增加(P<0.05)，但对弹性模量影响不明显。这说明补肾壮骨方能够增强去卵巢大鼠的骨强度。

体验式教学法，是指在教学过程中为了达到既定的教学目的，从教学需要出发，引入、创造或创设与教学内容相适应的具体情境或氛围，以引起学生的情感体验，帮助学生迅速而正确地理解教学内容，促进他们心理机能全面和谐发展的一种教学方法。体验式教学法使学生身临其境或如临其境，一则带给学生从形象的感知到抽象的理性的顿悟，二则激发学生的学习兴趣和学习情绪，使学习活动成为自主自发的活动。同时，在教学实践中，体验式教学法在英语阅读课、写作课研究相对较多，而将其运用到语法课研究的则比较少。[1]

铂族金属是一类具有战略地位的工业金属，由于其特殊的物理化学性质，铂族金属在现代工业、国防 和科技发展中具有关键的作用，被誉为现代工业维他命［1］。自然界中铂和钯含量极其微小，常以有色金属的硫化物、砷化物或硫砷化物作为其载体矿物方式存在。在铜、镍等大宗产品电解精炼冶炼过程中，铂钯与金、银、钌等稀贵金属均富集于对应的阳极泥中，作为副产物进行回收［2］。

1.3.2骨密度的测定。采用双能X线(DEXA)小动物成像仪对大鼠股骨进行扫描，选定股骨远端为兴趣区域进行图像分析，得到股骨的BMD。

1.3.3骨微结构的测定。采用VivaCT40(Scanco medical，瑞士)扫描大鼠股骨，选定股骨头下0.5 cm为兴趣区域进行图像分析，得到骨表面积与体积分数比(BS/BV)、骨小梁体积分数比(BV/TV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、结构模型指数(structure model index，SMI)和连接密度(Conn.D)参数值，并进行分析比较。

1.3.4骨生物力学测定。采用微机控制电子万能试验机(WF-4005，深圳市瑞格尔仪器有限公司)进行三点弯曲实验。将股骨生理弯曲面向上放置，并使股骨中心、两支点中心及加载点重合，然后按1 mm/min下降速度加载负荷，根据载荷-位移曲线计算最大载荷、最大应力和弹性模量。

血清中的ALP、PINP和OCN反映骨形成，血清CTX-I和尿液DPD是反映骨吸收的生化指标。各组大鼠血清指标结果见图1。由图1可知，与假手术组(Sham)大鼠相比，模型组(OVX)大鼠血清中ALP、CTX-I、OCN、尿液中DPD含量明显升高(P<0.05或0.01)，血清中PINP含量明显下降(P<0.05)。与模型组(OVX)大鼠相比，去卵巢大鼠经阿仑膦酸钠、补肾壮骨方水提液低剂量和高剂量治疗后，其血清中ALP、CTX-I、OCN和尿液中的DPD含量降低(P<0.05或0.01)，PINP含量显著升高(P<0.05或0.01)。

1.3.6Western blot测定Cathepsin K的表达。参照Ma等[8]描述的实验方法进行，并简述如下：提取胫骨蛋白，将80μg蛋白溶液加到12%的SDS-PAGE电泳胶电泳，分离后转印至PVDF膜，然后将膜与Cathepsin K(1∶500)和β-actin(1∶1000)4 ℃共孵育过夜。然后将膜与相应的二抗室温共孵育1 h，用ECL超敏发光液显色，Azure c300化学发光成像系统拍照，并用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量灰度值分析。

大鼠股骨HE染色结果(物镜×10)如图2所示。由图2可知，假手术组(SHAM)大鼠股骨骨小梁排列紧密，结构完整。模型组(OVX)大鼠股骨骨小梁结构松散不规则，细长疏稀，出现断裂，脂滴增多。阿仑膦酸钠组、补肾壮骨方水提液高剂量(SG)和低剂量组(SD) 大鼠股骨骨小梁增多，排列紧密，脂滴数量减少，骨微结构形态得到改善。

1.4 统计学方法

1.2.2动物的分组及给药。造模一周后，进行阴道涂片实验，连续5 d无动情周期即为去卵巢实验成功。取造模成功的大鼠36只，按照体重随机等分为模型组(OVX)、阿仑膦酸钠组(ALN)、补肾壮骨方水提液低剂量组(SD)和补肾壮骨方水提液高剂量组(SG)。假手术组大鼠(SHAM)9只。其中，补肾壮骨方水提液低剂量组(SD)、高剂量组(SG)大鼠分别灌服0.7 g/kg和1.4 g/kg的补肾壮骨方水提液，阿仑膦酸钠组(ALN)灌服阿仑膦酸钠0.12 g/kg。假手术组和模型组大鼠给予等体积的蒸馏水。各组大鼠连续灌胃12周后，分别取血液、尿液、股骨、胫骨等进行相应的检测。

2 结果

2.1 补肾壮骨方对去卵巢大鼠血液及尿液中钙和磷含量的影响

钙磷等矿盐是骨组织钙化的重要成分，其血清和尿液的含量变化可以间接反映出骨矿物质的代谢情况。补肾壮骨方对大鼠血清和尿液钙磷检测结果见表1。从表1可知，与假手术组(SHAM)大鼠相比，模型组(OVX)大鼠血清中钙(S-Ca)和磷(S-P)水平均显著降低，尿液中的钙(U-Ca/Cr)、磷(U-P/Cr)水平均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。与模型组(OVX)大鼠相比，阿伦膦酸钠组、补肾壮骨方水提液低剂量组(SD)血清中钙(S-Ca)和磷(S-P)水平均显著升高，尿液中的钙(U-Ca/Cr)和磷(U-P/Cr)水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)； 补肾壮骨方水提液高剂量组(SG)血清中钙(S-Ca)、磷(S-P)水平均显著升高，尿液中(U-P/Cr)磷水平显著降低(P<0.05或0.01)，尿液中钙(U-Ca/Cr)含量虽有一定程度降低，但差异不具有统计学意义。这说明补肾壮骨方可以改善去卵巢大鼠的钙磷代谢，从而增加骨组织矿物质含量。

表1 补肾壮骨方对去卵巢大鼠血清和尿液中钙和磷含量的影响

注：与模型组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组大鼠相比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 补肾壮骨方对去卵巢大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量的影响

脂代谢与骨代谢具有密切相关性[9]。各组大鼠血脂代谢中相关指标检测结果见表2。由表2可知，与假手术(SHAM)相比，模型组(OVX)大鼠血清中TC、TG、LDL含量明显升高， HDL含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。给予阿仑膦酸钠、补肾壮骨方水提液低剂量治疗12周后，与去卵巢组大鼠相比，大鼠血清中的TC、TG、LDL含量明显降低，HDL含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组大鼠血清中的TC、TG、LDL含量明显降低(P<0.05或0.01)，HDL含量升高。

2.3 补肾壮骨方对去卵巢大鼠血清ALP、PINP、CTX-I、OCN和尿液DPD的含量的影响

1.3.5骨组织HE染色。取左侧股骨组织做成石蜡切片，按照王丽丽等[7]提供方法进行HE染色，封片后置于Olympus BX53倒置显微镜拍照观察骨组织的病理变化。

表2 补肾壮骨方对去卵巢大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量的影响 Table 2 Effect of Bushen Zhuanggu Compound on the levels of TC, HDL, TG, LDL in the serum of ovariectomized rats s)

注：与模型组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组大鼠相比较，#P<0.05，##P<0.01。

图1 补肾壮骨方对去卵巢大鼠血清和尿液骨转换标志物含量的影响Fig.1 Effect of Bushen Zhuanggu Compound on the levels of serum and urine turnover markers in ovariectomized rats注：与模型组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组大鼠相比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 补肾壮骨方对去卵巢大鼠股骨密度和骨组织微结构的影响

骨质疏松不仅导致骨量的降低，同时也会诱发骨组织微结构的破坏。各组大鼠的骨CT实验结果见表3。与假手术组(SHAM)大鼠相比，模型组(OVX)大鼠的股骨骨密度显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组(OVX)大鼠相比，阿仑膦酸钠组、补肾壮骨方水提液低剂量组(SD)和高剂量组(SG)大鼠的股骨骨密度显著升高。

表3 补肾壮骨方对去卵巢大鼠骨密度和骨微结构改变的影响 Table 3 Effect of Bushen Zhuanggu Compound on the changes of micro-structures in ovariectomized rats s)

注：与模型组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组大鼠相比较，#P<0.05，##P<0.01。

1.1.2动物。3月龄雌性SD大鼠，平均体重220～240 g，购自斯贝福(北京)实验中心，饲养于北京中医药大学科研实验中心屏障级动物实验室(合格证号 SCXK(京)2016-0038)，室温 20 ℃，相对湿度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h，普通饲料喂养，实验期间大鼠自由进食和进水。

2.5 补肾壮骨方对去卵巢大鼠股骨的生物力学的影响

1.3.1血清和尿液生化指标的测定。取血液和尿液，按照试剂盒说明书测定血清中的Ca、P、HDL、LDL、TC、TG、PINP、CTX-I、OCN、DPD的含量；血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)用放免法测定。

组别剂量/(g/kg)弹性模量/GPa最大应力/MPa最大载荷/NSHAM-8.51±0.25∗255.90±5.74∗∗140.30±4.13∗OVX-6.90±0.52#219.00±7.97##124.50±3.59#ALN0.128.55±0.38∗236.40±4.36#138.40±2.20∗SG1.307.80±0.16256.80±9.08∗138.70±4.44∗SD0.707.92±0.37242.50±2.52∗147.50±7.29∗

注：与模型组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组大鼠相比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.6 补肾壮骨方对去卵巢大鼠股骨病理形态的影响

《青苗法》每年获利息300万贯。单以熙宁六年为例，青苗利息就达 292万贯；《免役法》每年获利1872万9千3百，而支出只用所入的三分之一；《市易法》每年息钱和市利钱多达达133万2千缗之多。不仅如此，各州县岁收也大大增加。据统计，“诸路常平、免役、坊场、河渡、户绝庄乡之钱粟积于州县者无虑数十百巨万”，如作为地方政府经费，“可以支24年用”。 以上四组材料，充分说明王安石变法确实达到了“富国”的目的。

对于我国的智能电网，从当前的使用来看，遗传算法和神经网络这两种算法得到了广泛的应用，这也让电力系统智能化能够有一个非常坚实的基础。神经网络能够对电力系统中一些复杂的非线性问题进行计算，从而解决问题，而基础为生物神经系统的人工神经网络，由于其科学化、高效化以及智能化的特点，在智能电网的应用非常的普及。同时也随着现代科学技术的飞速发展，我国对于智能电网的建设脚步也不断的加快，继电保护技术智能化的发展也越来越迅速。同时，对神经网络方法进行运用，分析系统故障的样本信息，能够在最快的之间只能发现发生故障的部位，从而对故障能够及时的进行排除，让系统的工作效率有效提升。

图2 大鼠股骨HE染色(物镜×10)Fig.2 HE staining of femur in rat (objective len×10)

2.7 补肾壮骨方对去卵巢大鼠骨组织Cathepsin K表达的影响

各组大鼠骨组织中Cathepsin K的表达结果见图3。由图3可知，与假手术组(SHAM)大鼠相比，模型组(OVX)大鼠股骨组织中的Cathepsin K的表达明显升高(P<0.05)；与模型组(OVX)大鼠相比，阿仑膦酸钠和补肾壮骨方(低剂量和高剂量)能显著降低去卵巢大鼠Cathepsin K的表达水平(P<0.05)，其中低剂量效果在降低Cathepsin K表达水平方面效果更明显(P<0.01)。这说明补肾壮骨方可能通过抑制Cathepsin K 表达进而改善骨质量。

图3 大鼠骨组织Cathepsin K的表达结果Fig.3 Cathepsin K expression in bone tissue注：与模型组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组大鼠相比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

中医认为，肾藏精主骨、肝藏血主筋、肝肾同源而精血互生。肾功能失常如肾精虚或肾气虚，则会导致骨骼失养，痿软无力。肝肾生理功能异常，则可能导致骨质疏松。肝血不足可导致肾精亏损。肝血虚则筋脉失养，肢体屈伸不利，筋骨运动失常，从而诱发骨痿[10]。补肾活血方由丹参、淫羊藿、熟地等组成。其中，丹参能活血化瘀，熟地黄具有补肝肾强筋骨的功效，淫羊藿具有温肾精、强筋骨的功效。基础研究也表明，丹参[11]、地黄[12]、淫羊藿[13]单独应用能明显改善骨质疏松动物的骨微结构和骨质量。临床观察也表明，该方能显著改善骨质疏松患者的临床症状，减轻患者骨量的丢失。

骨代谢的异常是诱发骨结构破坏和骨质疏松的主要原因。钙和磷是骨组织的主要成分，研究发现骨质疏松患者的钙和磷的排泄量明显增加。本实验研究也发现，补肾壮骨方能显著抑制去卵巢大鼠尿钙和磷的排泄，提高血清中钙和磷的含量。同时也发现，去卵巢大鼠骨胶原降解加速，表现为血清中PINP的含量明显降低，血液中的CTX-I和尿液中DPD的含量明显升高。给予去卵巢大鼠补肾壮骨方治疗12周，能明显逆转骨胶原血清学指标，抑制去卵巢诱发的骨吸收。同时，本研究用骨生物力学、骨密度和骨微结构评价补肾壮骨方对骨物理性质的影响。实验结果表明，该方能明显提高去卵巢大鼠股骨的最大载荷和弯曲强度，抑制骨量的丢失以及骨微结构的破坏。

去卵巢诱发的骨质疏松是一种高转换状态的骨代谢过程，表现为血清中ALP活性明显增高[14]。补肾壮骨方能明显降低血清中ALP的活性，抑制骨代谢的高转换率。OCN是由成骨细胞生成并特异性分泌的非胶原蛋白。研究发现，去卵巢大鼠的OCN含量明显降低[15]，这提示成骨细胞的骨形成能力明显降低。本实验研究发现，该方能提高去卵巢大鼠血清OCN的含量，从而促进骨形成。

（三）仅注重软件的操作和结果的分析，却忽视了对统计原理的深度分析和统计思想的逐步渗透，理论讲授不够立系统、深入和立体。

Cathepsin K活性的增高诱发破骨细胞骨吸收增强，是去卵巢诱发骨质疏松的主要原因之一[16]。研究发现，淫羊藿的主要成分淫羊藿苷(icariin)能通过抑制Cathepsin K的活性而抑制胶原诱发的骨关节炎[17]。笔者前期研究也发现丹参的主要水溶性成分丹酚酸B能降低高脂饮食小鼠牙槽骨组织Cathepsin K的表达水平改善骨代谢[7]。丹参脂溶性成分丹参酮也能抑制Cathepsin K的活性[18]。本实验研究也证明，以丹参和淫羊藿为主要成分的补肾壮骨方能降低骨组织Cathepsin K的表达。这说明该方抗去卵巢诱发的大鼠骨量降低的机理之一可能在于抑制Cathepsin K的活性。

4 结论

本实验通过观察补肾壮骨方对去卵巢大鼠血清和尿液的骨代谢指标、骨微结构和骨生物力学的影响，证明补肾壮骨方能够增强去卵巢大鼠的骨生物力学和改善骨微结构可能与改善骨代谢、抑制骨吸收和促进骨形成有关。这为其临床应用预防和治疗骨质疏松症提供了实验依据。这种骨组织的保护作用可能与抑制Cathepsin K的活性有关，但该方抗骨质疏松的深层次分子机制有待于进一步探讨。