不同浓度麝香含药血清对骨髓间充质干细胞迁移影响的实验研究

李应福 谢兴文,2* 李宁 侯费祎 蒋国鹏 潘鑫戊 周文杰

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 7300502.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 7305003.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 7300004.兰州军区总医院，甘肃 兰州 730050

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)具有较强的多向分化潜力和增殖能力[1-2]，研究发现在损伤部位使用适当的生长因子或细胞因子联合生物相容性良好、无组织刺激、容易塑性、可被机体吸收的生物支架上可刺激BMSCs向成骨或软骨方向分化[3-4]。这充分利用了BMSCs易获取、培养时间短、分化潜能高、细胞黏附性好、增殖速度快、免疫耐受性好、低排斥反应、其特征不会随机体的衰老而失去活性等特性，同时也为组织工程学研究治疗骨缺损、骨折等疾病带来了新的希望。尽管BMSCs移植能治疗创伤、心脑血管等疾病，但由于BMSCs体内数量有限，能迁移至损伤部位参与修复的BMSCs更少，这会影响其修复效果[5-6]。因此，研究促进BMSCs大量增殖并快速迁移的方法具有重要意义。麝香的有效成分是麝香酮，有研究表明麝香酮可促进BMSCs在体内的增殖，并诱导其向成骨细胞分化[7]。本实验通过麝香含药血清干预体外BMSCs，研究其对大鼠BMSCs增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SD大鼠60只，雌雄各半，体重(200±20)g，用于制备含药血清，雄性SD大鼠15只，体重(170±20)g，用于提取BMSCs，购于甘肃中医药大学SPF实验中心。实验动物质量合格证号：SCXK 甘 2015-0002，动物饲养于甘肃中医药大学SPF实验中心。

1.1.2实验药物、试剂：麝香(兰州安泰堂天顺行药业公司，批号：20151001)由甘肃中医药大学中药鉴定学教研室鉴定，为天然麝香。氯胺酮(西安力邦制药有限公司，国药准字H20054749)；DMEM/F12培养基(HyClone公司，批号：AAL208968)，胎牛血清(Gibco公司，批号：17423078)，成骨诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司，批号：T160608G001)，成脂诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司，批号：T160104G001)，FITC标记兔抗鼠CD90、CD44、CD45(美国Bio Legend公司)，FITC标记兔抗鼠CD34(美国Abcam公司)。

1.1.3实验设备：二氧化碳培养箱(MCO-5AC型，日本三洋电机公司)，自动摄像倒置相差显微镜(PW-30型，日本OLYMPUS公司)，立式电热压力灭菌器(LMQ型，山东新华医疗器械有限公司)，6、24孔细胞培养板(CORNING，美国Coring Costar)，流式细胞检测仪(COULTER EPICS XL，美国Beckman FAScan公司)，超净工作台(SW-CJ-1 FD 型，苏州净化股份有限公司)，低速台式离心机(TDZ4-WS型，长沙平凡仪器有限公司)，超纯水系统(NW型，北京Heal Force公司)。

1.2 方法

1.2.1分组与给药：60只SD大鼠采用随机数字表法分为麝香高剂量组(16.8 mg/100 g)、麝香中剂量组(8.4 mg/100 g)、麝香低剂量组(4.2 mg/100 g)及空白对照组，共4组，每组15只(高剂量组：雄性6只，雌性9只；中剂量组：雄性8只，雌性7只；低剂量组：雄10性只，雌性5只；空白组：雄性6只，雌性9只)，将麝香充分研磨成细末并利用生理盐水稀释至2.5 mL，制成麝香混悬液进行灌胃，空白对照组灌服相同体积的生理盐水。

1.2.2含药血清制备：高、中、低剂量麝香和生理盐水灌胃SD大鼠，每日1次，连续灌胃8 d，第8天灌胃2 h后行腹主动脉采血，4 ℃离心(3 000 r/min)10 min，取上层血清，过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.2.3体外分离、培养、鉴定BMSCs：参照Xie等[8]全骨髓贴壁筛选法，SD大鼠脱颈处死，无菌分离双侧股骨与胫骨，利用无菌纱布块剥离附着于股骨与胫骨的肌肉并将其分离，剪去股骨与胫骨干骺端，显露骨髓腔，用5 mL无菌注射器抽取含10%FBS、100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白，制成单细胞悬液，过滤并接种于60 mm无菌细胞培养皿中，4 mL/皿，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。原代细胞隔1 d半量换液，换2次后每3 d换液。待原代细胞融合成单层后，可用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化细胞，按1∶3比例接种到新的无菌培养皿中，每3 d换液1次。当细胞融合成单层或接近单层时可继续传代，传至P3代时，用于后续实验。细胞接种后每3 d在倒置相差显微镜下观察BMSCs形态。P3代细胞达到80%～90%融合时，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化细胞，将细胞悬液1 000 r/min离心10 min，吸弃上清，加PBS后1 000 r/min离心10 min，弃上清，加PBS并制成单细胞悬液，调整为1×106cells/cm2，1 500 r/min离心10 min，弃上清，先加入90 μL PBS，吹打为细胞悬液，再加入一抗(CD34、CD45、CD90、CD44)及其同型对照各10 μL，37 ℃避光30 min后加400 μL PBS，上流式细胞仪检测。

1.2.4细胞成骨、成脂诱导：用胰酶消化P3代细胞，调整细胞为2×104cells/cm2接种在包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，置入37 ℃、含5%CO2培养箱内培养，当细胞达60%～70%融合度时，加入2 mL成骨诱导完全培养基，每3 d换液1次。诱导17 d后，用茜素红染色法对钙化结节染色；当细胞融合度达90%～100%时，加入2 mL成脂诱导完全培养基A液，诱导3 d后，吸弃A液，加入2 mL成脂诱导完全培养基B液，24 h后吸弃B液，换A液诱导，A液和B液交替作用18 d后，继续用B液培养7 d，共诱导25 d后进行油红O染色。

1.2.5MTT法检测麝香含药血清对BMSCs增殖的影响：P3代BMSCs加入含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化细胞，制备单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清加入完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×l05个/mL，按每孔2×104个接种至96孔板，分为空白组血清、麝香低、中、高剂量组血清，浓度均为5%完全培养液，各组培养液中均含有5% FBS，每组10个孔。每孔依次加入不同组别的完全培养液200 μL，24 h后加入20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，摇床震荡10 min，490 nm波长检测各孔OD值。每24 h换液一次，连续检测7 d样品OD值，重复3次。

1.2.6Transwell小室检测麝香含药血清对BMSCs迁移的影响：P3代BMSCs融合度达80%～90%时，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化细胞加入无血清培养基，按1×105cells/cm2的细胞密度接种在24孔Transwell孔板上层培养小室中，分为不同浓度麝香含药血清组、空白对照组共4组，每组6个复孔，每孔200 μL，实验重复2次。在Transwell孔板下层培养小室中分别加入含5%的含药血清、5%空白组血清完全培养液，置于37 ℃、含5%CO2培养箱内培养，分别在24 h、48 h、72 h测细胞迁移。检测步骤：(1)取出24孔培养板，吸弃小室上层培养基，将小室转移至新孔中；(2)PBS冲洗小室2次，弃PBS；(3)4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗小室2次，弃PBS；(4)超净工作台内适当风干后，加1%结晶紫溶液，避光染色15 min，吸弃染液；(5)PBS冲洗小室2次，弃PBS；(6)用棉球擦去小室上室的细胞，PBS冲洗小室2次，弃PBS；(7)每个小室随机选取6个视野，拍照计数，紫色细胞为迁移的细胞。倒置相差显微镜下(×20)拍照，细胞计数后取其平均值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞形态学观察

倒置相差显微镜下观察，原代BMSCs第2次换液后细胞贴壁清晰可见，集落性分布，分离间距大，同时可见大量圆形杂细胞，多呈短棒状(图1)，P1代BMSCs培养3 d时细胞大量贴壁，形态以圆形和短梭形多见(图2)；P2代BMSCs 2 h内迅速贴壁，培养3 d时梭形状增殖，体积变大，具有细胞突起(图3)；P3代BMSCs贴壁快、生长速度快，培养3 d时细胞集落快速增殖，体积明显增大(图4)。

图3 P2代BMSCs培养3 d (20×)Fig.3 P2 generation BMSCs culture 3 d (20×)

图4 P3代BMSCs培养3 d (20×)Fig.4 P3 generation BMSCs culture 3 d (20×)

2.2 细胞表型鉴定结果

CD90、CD44在干细胞表面的表达阳性率分别为93.8%、95.7%，CD45、CD34在干细胞表面的表达阳性率分别为0.4%、0.0%，说明CD90、CD44是阳性表达(图5、6)，CD45、CD34是阴性表达(图7、8)。

图5 CD90表达Fig.5 Expression of CD90

图6 CD44表达Fig.6 Expression of CD44

图7 CD45表达Fig.7 Expression of CD45

图8 CD34表达Fig.8 Expression of CD34

2.3 BMSCs成骨、成脂分化

经茜素红染色后，倒置相差显微镜下可见圆形、梭形、多边形矿化不透明结节，呈橘红色的钙化结节(图9)。经油红O染色后，倒置相差显微镜下可见细胞浆内呈大小不等的圆形或椭圆形、排列整齐规则的红色脂肪滴颗粒(图10)。

图9 BMSCs成骨诱导(20×)Fig.9 BMSCs osteogenic induction (20×)

图10 BMSCs成脂诱导(20×)Fig.10 BMSCs induced adipogenesis (20×)

2.4 麝香含药血清对BMSCs增殖、迁移的影响结果

表1 不同浓度麝香含药血清对BMSCs增殖率的影响 Table 1 Effects of different concentrations of musk containing serum on the proliferation rate of BMSCs

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表2 不同浓度麝香对BMSCs迁移的比较 Table 2 Comparison of migration of BMSCs at different concentrations of musk

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量组比较，ΔP<0.05。

2.4.1MTT结果：MTT结果显示(图11，表1)，不同组间比较，各个时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，第1天麝香高、中、低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量组更显著(P<0.01)；第2天麝香低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，第3天麝香中、低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量组更显著(P<0.01)；第4、5天麝香低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，第6天麝香中、低剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)；第7天麝香低剂量组差异有统计学意义(P<0.01)，说明麝香低剂量对BMSCs增殖影响最大。

图11 不同组别BMSCs生长曲线Fig.11 Growth curves of BMSCs in different groups

2.4.2Transwell细胞迁移实验：结果显示(表2)，不同组间比较，24 h、48 h、72 h的差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，孵育BMSCs 24 h时，麝香高、中、低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组更显著(P<0.01)；孵育BMSCs 48 h时，麝香中、低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量组更显著(P<0.01)；孵育BMSCs 72 h时，麝香低剂量组差异有统计学意义(P<0.01)；与麝香低剂量组比较，麝香高剂量组孵育BMSCs 24 h时差异有统计学意义(P<0.05)，麝香中剂量组孵育BMSCs 48 h、72 h时差异有统计学意义(P<0.05)。不同时间段组内比较，差异无统计学意义(P>0.05)。提示不同浓度麝香均能促BMSCs迁移，以麝香低剂量组效果最好。

研究结果显示(图12～14)，组间比较，孵育24 h、48 h、72 h时BMSCs迁移数均随着麝香浓度的降低而逐渐增加，空白组其迁移数最少； 组内比较，不同时间段各组BMSCs迁移数均增加。

图12 孵育24 h对BMSCs的迁移情况(A～D依次为麝香高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组)Fig.12 Incubation for 24 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

图13 孵育48 h对BMSCs的迁移情况(A～D依次为麝香高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组)Fig.13 Incubation for 48 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

图14 孵育72 h对BMSCs的迁移情况(A～D依次为麝香高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组)Fig.14 Incubation for 72 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

3 讨论

由于BMSCs具有取材简便、扩增迅速、低免疫原性、多向分化潜能等优点，被认为是移植领域或联合生物材料方面应用前景广阔的种子细胞[9]，越来越多地用于骨科和内科临床难治性疾病的治疗。虽然BMSCs在全骨髓中含量为0.0001%～0.0010%，但一方面选择纯化度高的体外培养BMSCs方法时其具有很强的增殖分化、迁移潜能，另一方面选择一种载体或药物干预时其具有迅速增殖、定向分化并迁移至损伤部位的作用[10]，目前后者是研究的热点之一。近年来，众多学者应用现代科技手段多方位、多角度、多层次对中药促进BMSCs增殖、分化、迁移方面做了大量实验研究并取得了满意的效果。熊云谱等[11]通过补肾活血汤含药血清的干预观察对BMSCs迁移的影响，发现补肾活血汤可促进BMSCs的增殖和迁移，而这种迁移机制与活化SDF-1/CXCR4轴具有相关性，这为临床治疗加快骨折愈合、缩短骨折愈合时间及防止骨折延迟愈合等疾病提供了基础依据。王俊等[12]观察中药川芎嗪对BMSCs迁移的影响，通过采用Transwell细胞迁移、细胞划痕、Western blot实验发现川芎嗪在体外能促进BMSCs迁移，其机制与上调基质金属蛋白酶-2、9表达有关。黄小兵等[13]通过龟板含药血清对BMSCs的干预，发现龟板含药血清明显增强BMSCs的迁移能力，且与浓度呈正相关。以上从另一方面验证了中药单体或复方具有促进干细胞迁移的作用，具有很大的研究价值。

传统名贵稀有中药麝香，味辛、性温，具有引药达损伤部位，预防和治疗疾病的作用，是引经药物代表之一。笔者通过制备不同浓度麝香含药血清，体外干预大鼠BMSCs，观察麝香对其增殖、迁移的影响。在促BMSCs迁移实验中，Transwell孔板下层培养小室中分别加入含5%的含药血清、5%空白组血清完全培养液，这样不仅能充分发挥细胞的生物学活性，而且最大程度地避免血清中含有的其他成分影响BMSCs的迁移作用。实验结果表明，体外BMSCs自身可能具有迁移能力，不同浓度麝香在24 h、48 h、72 h更能促进BMSCs的迁移能力，并且其迁移数量随着麝香浓度的递减及时间延长而增加，这与细胞增殖率的结果相一致。说明麝香促BMSCs迁移效应与浓度呈负相关、与时间呈正相关，因此促BMSCs迁移能力最强的是低浓度麝香。

总之，本研究结果表明，麝香在体外能促进BMSCs迁移，与浓度呈负相关。这对探讨外源性BMSCs输入体内，使其迁移至骨折、骨缺损处，从而加快修复速度具有极其重要的意义，也为治疗内科、骨伤科等疾病提供新的思路。但麝香中剂量组和高剂量组为何促增殖及迁移作用小？具体通过调控哪些细胞因子、生长因子以及活化哪条或哪些信号通路的开放促进BMSCs迁移？还需要不懈的研究与探索。