不同炮制方法对菟丝子总黄酮和多糖含量及抗氧化能力的影响

燕宇真，王慧春，曾 阳

（青海师范大学生命科学学院，青海西宁 810099）

菟丝子（Semen cuscutae）为旋花科菟丝子属菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）的种子。菟丝子被历代医家视为平补肝、肾、脾经的要药[1]，用于阳痿遗精、尿有余沥、遗尿尿频、腰膝酸软、目昏耳鸣、肾虚胎漏、胎动不安、脾肾虚泻和外治白癜风等病症[2]。菟丝子的良好疗效源自其含有的黄酮、多糖、生物碱、萜、甾体、挥发油和木质素等化合物[3-7]。然而，《中华人民共和国药典》 （本文简称《药典》）仅对菟丝子的总灰分、酸不溶性灰分和金丝桃苷含量进行了描述。此外，在菟丝子的用药历史上存在盐炙法、清炒法、粉碎法、酒炙法等多种炮制方法。但是，临床用菟丝子的炮制方法大多为《药典》规定的将菟丝子水洗晒干后使用的方法（本文简称“水洗晒干法”）。试验综合比较分析了雷公炮炙论中所记载的菟丝子炮制方法（简称“雷氏法”）、酒炙法、盐炙法、粉碎水煮法、水煮吐丝法、清炒法和水洗晒干法等7种炮制处理的菟丝子分别在水和醇提取物中总黄酮和多糖含量及抗氧化能力，从而为科学加工和利用菟丝子提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菟丝子，购于河北安国药材市场。

试验用FRAP，购于美国Sigma公司；乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、苯酚、浓硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁等，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BS200S型电子天平、QE-100g型高速中药粉碎机、DZF-6030型真空干燥箱、KH5200B型超声波清洗器、TGL-16型高速台式冷冻离心机、UV-754型分光光度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将干净干燥的菟丝子分为7组（每组300 g）。参照雷公炮制法和现代炮制工艺，设定了雷氏法、酒炙法、盐炙法、粉碎水煮法、水煮吐丝法、清炒法和水洗晒干法等7种炮制方法。

（1） 雷氏法（LS）。参照雷敩等人[8]的方法：将100 g菟丝子用30 mL米醋浸泡72 h，沥水，用微火煎至干后粉碎，烘干备用。

（2） 酒炙法（JZ）。参照张汉明[9]和李春雨等人[10]的方法，将100 g菟丝子用30 mL黄酒拌匀，湿润24 h，再用流通蒸汽蒸1 h，取出趁热捣成稠粥状，做饼，切成小块，烘干备用。

（3） 盐炙法（YZ）。参照曾诠[11]和李春雨等人[12]的方法，将100 g菟丝子用30 mL盐水（15∶1，V/W）拌匀，焖润至盐水尽，置锅内用文火炒至爆声为度，放凉备用。

（4） 粉碎水煮法（FSSZ）。参照郭澄等人[13]的方法，将100 g菟丝子粉碎，加30 mL蒸馏水浸泡1 h，置锅内边煮边铲，取出压干成块状，烘干备用。

（5） 水煮吐丝法（SZTS）。参照郭澄等人[13]的方法，将100 g菟丝子加30 mL蒸馏水浸泡2 h，置锅内煮，边煮边铲，至吐丝。稍冷取出压平，做成块状，烘干备用。

（6） 清炒法（QC）。参照郭澄等人[13]的方法，将100 g菟丝子置铁锅内，用文火加热，炒至微黄色，有爆裂声，放凉备用。

（7） 水洗晒干法（SXSG）。 参照《药典》[2]的方法将100 g菟丝子洗净，晒干备用。

1.3.2 样品提取

（1）水溶液超声提取法。参照Samec D等人[14]的方法，取5 g菟丝子，加75 mL蒸馏水，于40℃下水浴超声提取80 min，于转速10 000 r/min下离心10 min，收集上清液备用。

（2） 醇溶液超声提取法。参照伍晓春[15]的方法，取5 g菟丝子，加75 mL 15%乙醇，于40℃下水浴超声提取80 min，于转速10 000 r/min下离心10 min，收集上清液备用。

1.3.3 总黄酮和多糖含量及抗氧化能力测定

（1）总黄酮测定。参照伍晓春等人[15]的方法，精密移取5 mL提取液置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，精密加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，静置6 min，精密加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静置6 min，精密加入4%氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，用1 cm比色皿于波长510 nm处测定吸光度，总黄酮浓度按照线性方程A=0.012 98C-0.011 94（R2=0.999 7） 计算。

（2） 多糖测定。参照Dubois M等人[16]的方法，精密移取5 mL提取液置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水补足至6 mL，摇匀，分别精密加入4%苯酚1 mL，混匀，迅速加入硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热15 min，取出放冷，于波长491 nm处测吸光度，多糖浓度按照线性方程A=0.049 7C+0.016 3（R2=0.999 7）计算。

（3） 抗氧化能力（FRAP） 测定。参照崔施展等人[17]的方法，取浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L FeSO4溶液300 μL，加入9 mL FRAP试剂，于37℃下水浴10 min，于波长593 nm处测定吸光度，以吸光度为X轴、FeSO4浓度为Y轴，拟合回归方程。配制不同质量浓度FeSO4提取物溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL，按照以上操作，测定样品吸光度。样品抗氧化活性以相同吸光度所需FeSO4表示。

1.3.4 统一粒度试验

参照伍晓春[15]的方法，将菟丝子于80℃条件下干燥5 h，取出粉碎成细粉，过80目筛，备用。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同炮制方法对菟丝子总黄酮和多糖含量的影响

不同炮制方法制得菟丝子中总黄酮和多糖含量见表1。

由表1可知，相较于水洗晒干法制得的菟丝子，其余全部方法制得的菟丝子，总黄酮含量均有不同程度增加。水提物中，以雷氏法和粉碎水煮法炮制的菟丝子中总黄酮得率最高，二者含量分别为0.30%和0.23%，之后为酒灸法（0.17%） 和盐灸法（0.15%），水煮吐丝法和清炒法制得的菟丝子总黄酮含量为0.13%，增长不明显；在醇提物中，同样以雷氏法和粉碎水煮法炮制的菟丝子中总黄酮得率最高，两者含量为别为0.39%和0.36%。之后分别为酒灸法（0.22%）。盐灸法、水煮吐丝法和清炒法制得的菟丝子中总黄酮含量相似，为0.18%左右。上述结果表明，雷氏法和粉碎水煮法能够较其他炮制方法更好地促进菟丝子中黄酮类物质的释放。另外，醇提物中总黄酮含量明显高于水提物，说明醇能够更加高效提取菟丝子中黄酮类物质，这是因为醇是更加高效的植物性小分子酚类物质的提取剂[14]。

表1 不同炮制方法制得菟丝子中总黄酮和多糖含量/%

相较于水洗晒干法制得的菟丝子，只有部分其他方法制得的菟丝子多糖含量有不同程度增加。例如，采用粉碎水煮法、雷氏法和盐灸法炮制得到的菟丝子中多糖含量增加明显，分别达到了8.25%，6.24%和6.17%，之后为水煮吐丝法和清炒法；在醇提物中，粉碎水煮法和雷氏法制得的菟丝子中多糖含量增加明显，分别达到了10.15%和4.90%，说明雷氏法和粉碎水煮法能够较其他炮制方法更好地促进菟丝子中多糖物质的释放。结合对总黄酮含量的分析可以得出，雷氏法和粉碎水煮法能够较好地促进菟丝子中功能物质的释放，建议在临床使用中采用上述2种方法炮制菟丝子。造成这一现象的原因可能因为雷氏法、粉碎水煮法的炮制工艺中均含有粉碎工序，对菟丝子坚硬种皮进行了较彻底的粉碎处理，从而提高了其炮制品在水浸提时黄酮的溶出率，说明炮制效果好坏与种子的破碎程度有较大关系。同时也说明现行的药典方法尚有不足之处，建议改进或增加新的炮制方法，并考虑作为药典的方法。另外，其他方法制得的菟丝子，相较于水洗晒干法制得的菟丝子，多糖含量降低。例如，酒灸法制得的菟丝子水提物中多糖含量为2.58%；酒灸法、盐灸法、水煮吐丝法和清炒法制得的菟丝子醇提物中多糖含量均低于水洗晾干法的3.85%。这说明醇提取多糖物质效果没有水好，这可能是因为多糖类物质的分子量普遍大于黄酮类物质。

2.2 不同炮制方法对菟丝子抗氧化能力的影响

不同炮制方法制得菟丝子的FRAP值见表2，不同炮制方法制得菟丝子的抗氧化能力、总黄酮和多糖含量的相关性见表3。

表2 不同炮制方法制得菟丝子的FRAP值 /mg·g-1

表3 不同炮制方法制得菟丝子的抗氧化能力、总黄酮和多糖含量的相关性

由表2可知，相较于水洗晒干法炮制的菟丝子，其他方法得到菟丝子的抗氧化能力均得到了提升，其中雷氏法、盐灸法、破碎水煮法和清炒法对菟丝子的抗氧化能力提升效果较其他方法更加显著。例如，雷氏法、盐灸法和清炒法制得的菟丝子水提物的抗氧化力分别为8.66，8.08，8.32 mg/g；雷氏法、破碎水煮法和清炒法制得的菟丝子醇提物的抗氧化能力分别为13.14，12.10，10.30 mg/g。另外，醇提物的抗氧化能力总体高于水提物。造成这一结果的原因可能是，醇提物中总黄酮和多糖含量总体高于水提物。这也解释了表1中，酒炙法制得的菟丝子总黄酮含量较生品均有增加，说明酒精能够提高其所含成分的溶解度和可被吸收率。因此在日常应用中，菟丝子泡酒饮用有一定治疗效果。

多酚和多糖是菟丝子活性能功能的主要贡献物质，黄酮参与了菟丝子的补肾、安胎、调节免疫力等作用；而多糖参与了菟丝子免疫作用[18]。抗氧化是多酚和多糖物质实现功能活性的途径之一。因此，对菟丝子水提物和醇提物抗氧化能力，总黄酮及多糖含量进行了相关性分析。由表3可知，无论是菟丝子的水提物还是醇提物，总黄酮和多糖含量均与其抗氧化能力呈正相关。结果表明，黄酮和多糖都对菟丝子的抗氧化能力起到正向促进作用。如表1和表2所示，菟丝子醇提物中含有更多的总黄酮和多糖，而具有更强的抗氧化能力。

2.3 粒度对菟丝子总黄酮和多糖含量及抗氧化能力的影响

出于尊重传统炮制方法和实际用药过程中的习惯，在进行上述各项试验过程中，最大程度地保持了炮制完成后菟丝子的原貌，因此各种炮制品的粒度之间存在差异，这可能会对评价不同炮制方法对促进菟丝子活性物质的释放造成影响。因此，进一步将炮制后的菟丝子进行了统一粉碎，在统一粒度下来评价不同炮制方法对促进菟丝子活性物质释放的影响。另外，上述研究发现，醇在提取总黄酮物质中具有良好效果，并且多糖提取的最大程度值是由醇提得到的，从而醇提物具有更强抗氧化能力。因此，采用醇作为提取剂来进一步评价不同炮制方法对促进菟丝子活性物质释放的影响。

统一粒径菟丝子醇提物中总黄酮和多糖含量见表4。

表4 统一粒径菟丝子醇提物中总黄酮和多糖含量

结合表1和表4可知，不同炮制方法之间的差异与统一粒径之前相似，相比水洗晒干法制得的菟丝子，其他方法制得的菟丝子醇提物中总黄酮含量均增加，而除粉碎水煮法和清炒法制得的菟丝子多糖含量增加之外，其他方法制得菟丝子的多糖含量都不同程度地降低。但是无论是总黄酮还是多糖含量较统一粒径之前整体增加。说明破碎程度越小，越容易促进菟丝子活性物质的释放。另外，结合表2和表4可知，不同方法炮制后的菟丝子，统一粒径之后表现出来的抗氧化能力均有明显提升。这可能与粒度减小促进了活性物质的释放有关。因此建议，临床使用菟丝子应该再选取适当炮制方法之后对炮制品进行破碎处理降低粒度大小，以粉态物质入药，会促进活性物质的释放，从而增加其治疗效果。

3 结论

对不同炮制方法制得的菟丝子的水提物和醇提物中的总黄酮和多糖含量及抗氧化能力进行了测试分析，结果表明，相较于水洗晒干法，其他方法炮制得到的菟丝子水提物中总黄酮和多糖含量均增加，从而具有更强抗氧化能力，说明现行《药典》中规定的水洗晒干法需要进一步验证。统一粒度试验印证了破碎处理会促进菟丝子活性物质的释放，从而促进其抗氧化能力。雷氏法和破碎水煮法制得的菟丝子水提液和醇提液中总黄酮和多糖含量及抗氧化能力均有明显增加，说明雷氏法和破碎水煮法会促进活性物质的释放并加强菟丝子功能活性，建议作为新方法用于菟丝子炮制。另外，试验证明醇相较于水能够更好地提取菟丝子活性物质。因此，建议雷氏法、酒灸法和破碎水煮法连同破碎处理和醇提一起用于对菟丝子的入药前处理。