中药抗耐药铜绿假单胞菌机制的研究进展

刘传铃 王佳贺

[摘要] 铜绿假单胞菌已成为临床上最常见的医院内感染致病菌之一，其耐药性使临床上铜绿假单胞菌的抗感染治疗更加棘手。多重耐药性铜绿假单胞菌（MDR-PA）耐药机制复杂多变，且常由多种耐药机制同时作用产生多重耐药性。中药抗耐药铜绿假单胞菌的应用有望延缓、抑制甚至逆转铜绿假单胞菌的耐药性，中药能对MDR-PA耐药性产生的多个环节进行干预，本文综述了中药抗耐药铜绿假单胞菌机制的研究进展。这些研究发展为中药抗耐药铜绿假单胞菌的进一步研究提供了新的研究方法及思路。

[关键词] 中药;铜绿假单胞菌;耐药;耐药机制

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（c）-0040-04

[Abstract] Pseudomonas aeruginosa has become one of the most common pathogens of nosocomial infection in clinic， and its drug resistance has made it more difficult to treat the infection of Pseudomonas aeruginosa. The drug resistance mechanism of multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa （MDR-PA） is complex and changeable， and it often produces multiple drug resistance by simultaneous effects of multiple drug resistance mechanisms. Application of traditional Chinese medicine against drug-resistant Pseudomonas aeruginosa is expected to postpone， to inhibit or even reverse the drug resistance of Pseudomonas aeruginosa. Traditional Chinese medicine can intervene in multiple links in the production of drug resistance of MDR-PA. This article reviews the research progress on mechanism of traditional Chinese medicine against drug-resistant Pseudomonas aeruginosa. These studies provide new research methods and ideas for further study of traditional Chinese medicine against drug-resistant Pseudomonas aeruginosa.

[Key words] Traditional Chinese medicine; Pseudomonas aeruginosa; Drug-resistance; Drug resistance mechanism

銅绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又称绿脓杆菌，是一种条件致病菌，在临床上已成为最常见的医院内感染致病菌之一。正常情况下，PA并不感染人体的任何组织，但是当人体免疫力降低时或进行有创医疗操作后，PA几乎可以感染人体任何组织。临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染，其中呼吸道感染、心内膜炎、脑膜炎和败血症等可危及患者生命。随着抗生素的广泛使用，多重耐药性铜绿假单胞菌（multiple-drug resistant Pseudomonas aeruginosa，MDR-PA）在临床上分离率逐年增高，是临床抗感染治疗中的一个棘手的问题。PA在部分地区ICU病区对半合成青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类及氟喹诺酮类耐药率均不低于40%[1]。MDR-PA耐药机制复杂多变，且常由多种耐药机制同时作用产生多重耐药性，使得MDR-PA感染治疗更加困难，需要我们在原有的治疗方案基础上需求新的突破。

中药在抗感染治疗方面因抗菌谱广泛、不易耐药等优点逐渐成为研究的热点，中药抗菌的应用有望延缓、抑制甚至逆转PA的耐药性，中药抗耐药铜绿假单胞菌的机制主要有抑制抗菌药物水解酶，消除耐药质粒，恢复细菌对抗菌药物的通透性，抑制PA生物被膜的形成，抑制外排泵系统及调节机体免疫功能等。本文对中药抗耐药铜绿假单胞菌机制研究进展综述如下：

1 PA的耐药机制

PA的耐药机制复杂，变化迅速，主要有如抗菌药物水解酶、耐药质粒、外排泵系统、生物被膜、细胞通透性改变及药物作用靶位改变等。

1.1 抗菌药物水解酶

PA耐药机制之一是抗菌药物水解酶的产生，包括头孢菌素酶（AmpC）、超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）及金属β内酰胺酶（metallo-β-lactamases，MBL）等。AmpC酶全称是AmpC β内酰胺酶，可由β-内酰胺类抗生素诱导高表达，使β-内酰胺类抗生素水解，从而产生耐药。生物体内的ESBLs也能够水解β-内酰胺类抗生素或降低其活性。有研究提示，MBL是PA多重耐药产生的重要因素，且主要产生以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素耐药性[2-3]。这种耐药机制还能使PA的耐药能力可以不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制[4]。

1.2 耐药质粒

质粒耐药性是细菌通过遗传产生耐药性的主要机制，质粒是细菌核质以外的DNA，其种类繁多，携带着耐药基因的质粒称为R质粒。R质粒不仅可以在细胞分裂时经过复制传给子代细菌，还可以通过媒介（菌毛、噬菌体等）从耐药菌传给敏感菌，从而使得耐药性快速传播。钟鸣[5]发现PA多重耐药菌株有50%携带质粒DNA，消除其质粒后耐药性消失，说明R质粒与PA多重耐药性产生有关，且使其耐药性传播能力增强。

1.3 外排泵系统

外排泵系统（efflux pump system）即药物主动转运系统，是细菌耐药性产生的重要机制。外排泵产生高耐药是因其过度表达时会将进入细菌体内的大部分抗生素外排。多重耐药菌相关的外排泵包括主要易化超（major facilitator，MF）家族、耐药小结分裂（resistance-nodulation-division，RND）家族、链霉素耐药或葡萄球菌多重耐药家族及ATP-结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运器。PA的外排泵基因过表达是其多重耐药产生的重要机制，目前PA的7种主要外排泵系统均属于RND家族。

1.4 生物被膜

细菌生物被膜（baterial biofilm，BF）是细菌吸附于物体表面后，分泌的多糖基质等物质使细菌相互聚集并形成保护的膜状物。BF能抑制抗生素或白细胞从生物膜外进入细菌内，从而使细菌产生耐药性。研究证明PA产生BF能力强，BF是使PA感染反复的原因之一，它使得细菌常植于植入体表面不易被完全清除，抗感染难度增大，而且BF的存在使PA的耐药基因有充分的时间开启，抗菌药物水解酶的产量大于无BF的浮游菌。有报道显示被膜铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）显著高于浮游菌的MIC值[6]。

1.5 细胞膜通透性改变

抗生素通过细菌细胞膜进入细菌内部产生抗菌作用，反復用药会导致细胞膜膜孔蛋白的含量降低或结构改变，使细胞膜通透性降低，抗生素渗透性改变，从而导致PA的耐药性产生。PA细胞膜OprD2的缺失可能是造成其对亚胺培南耐药的原因之一。但一般来说细胞膜通透性的改变导致的耐药水平不高，主要是与其他耐药机制产生协同作用[7]。

1.6 药物靶位改变

药物靶位改变会使PA产生耐药性。PA青霉素结合蛋白（Penicillin binding proteins，PBPs）的改变会使其产生β-内酰胺类抗生素耐药性。在基因水平上，细菌DNA拓扑异构酶Ⅱ的基因突变会导致PA产生喹诺酮类药物的耐药性，因为喹诺酮类药物的抗菌机制就是抑制细菌DNA拓扑异构酶。

2 中药抗耐药铜绿假单胞菌机制

中药抗菌抗感染历史悠久，抑菌成分多样，对于MDR-PA可于抑菌层面产生作用，也能在其耐药性产生的多个环节进行干预。许多清热解毒药具有抗菌抑菌作用，如黄岑、连翘、薄荷、蒲公英及苦参等对PA均有抑菌作用，其中黄岑效果最强[8]。贺立群等[9]研究发现，焦栀子、黄芪及黄柏对铜绿假单胞菌耐药菌株的增殖生长有着不同程度的影响。除单种中药和中药提取物外，中药复方对PA也有着抑制作用。涤痰汤[10]有着较高的抑菌活性，能够抑制超级耐药菌形成酶的活性，对PA、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等都有着较好的抑菌作用。

2.1 抑制抗菌药物水解酶

芪归银方属于扶正透邪方，其本身无明显体外杀菌作用，但高洁等[11]通过研究发现芪归银方在体外可逆转耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性，且减慢β-内酰胺酶水解速率，这提示芪归银方逆转耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性的机制之一可能是抑制其β-内酰胺酶的水解。张志勇[12]利用双黄连注射液对MDR-PA的体外抑制作用，证明双黄连注射液对PA的β-内酰胺酶存在抑制作用，从而起到抗菌作用。

2.2 消除PA耐药质粒

质粒的消除可以通过理化作用来完成，但这对人体毒副作用大，所以利用中药消除PA的耐药质粒是值得我们研究的。中药五倍子、马齿苋、黄岑苷、白头翁等对PA的R质粒具有消除作用。因为中药对耐药质粒的消除机制还不甚明朗，所以中药对PA耐药性逆转的强弱与其耐药质粒消除率的大小是否具有相关性还需进一步研究。

2.3 中药对PA的生物膜作用

中药对PA的生物膜作用包括恢复细菌细胞膜对抗菌药物的通透性及延缓、抑制PA 生物被膜的形成，从而使抗生素更好地产生抑菌、杀菌作用，逆转PA的耐药性。盐酸小檗碱俗称黄连素，自黄连、黄柏、三颗针等植物中提取，具有显著的抑菌作用，可延缓PA生物膜的形成[13]。也可通过增加PA细胞膜通透性达到抑菌、杀菌的作用。所以盐酸小檗碱在理论上可以和抗生素合用，提高抗菌药物通过细菌细胞膜的能力，降低PA的耐药性。石庆新等[14]将盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用于耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌发现亚胺培南与盐酸小檗碱联用在体外对95%的耐药菌株有抑菌作用，且能加强彼此的抗菌能力。苦参水煎液[15]可以抑制PA BF的形成，与左氧氟沙星同用时产生协同作用。银翘散[16]也具有抑制PA BF形成的能力，能与阿奇霉素在抑制PA方面上产生协同抑菌作用。败酱草提取物[17]可以直接抑制生物膜相关基因的表达，防止生物膜的形成。李亚楠等[18]在研究黄芩素（baicalein，BCA）联合头孢他啶（CAZ）对小鼠腹腔PA早期BF感染的治疗作用时得出BCA单独作用可抑制小鼠腹腔PA感染早期BF的生长的结论，头孢他啶在与黄芩素联合应用时对BF的杀菌作用可明显增强。黄岑苷在与美罗培南（MEM）联用时也得出相同结论[19]。鱼腥草素钠[20]对PA的生物被膜有清除作用，且在实验中与亚胺培南等抗生素联用能加强其抑菌作用[21]。鱼腥草素钠联合聚维酮碘能增强聚维酮碘对PA生物被膜的抑制作用，两者产生协同抑菌作用[22]。黄岑[23]、大黄[24]等可通过群体感应（quorum-sensing，QS）影响生物被膜的形成。

2.4 中药对PA细菌外排泵的作用

现在PA研究最多的外排泵系统是MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN等。MexAB-OprM是最早被发现的PA外排泵系统，其作用底物广泛，包含β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类及大环内酯类等。外排泵的基因高表达也是PA产生碳氢酶烯类药物耐药性的重要原因。穿心莲内酯是具有良好抗感染作用的穿心莲二萜内酯类提取物，其对PA外排泵MexAB-OprM转录表达具有抑制作用，可扭转PA的部分耐药性。但也有研究表明，部分清热解毒药（如黄芩、金银花、夏枯草）在对MDR-PA外排泵的作用中表现出与抗生素为拮抗作用，且夏枯草、穿心莲、金银花及五倍子能促进MDR-PA外排泵的基因表达[25]。所以中药对于PA外排泵系统的研究还需更加深入。

2.5 中药免疫调节能力

机体免疫能力在细菌感染过程中处于至关重要的地位。PA感染当人体免疫力降低（烧伤、创伤、炎症、器官衰竭等）时容易发生，且MDR-PA感染所致的机体免疫功能损伤更为严重。中药具有调节免疫功能的作用，中药抗细菌耐药的机制之一就是提高免疫力、消除炎性反应。对于PA感染的疾病而言，中药可使感染所致的免疫紊乱趋于平稳，减少炎性细胞因子的释放，改善感染症状，加强机体免疫力，从而使PA感染得到控制。这使得在一定程度上可减少抗生素的应用，使PA耐药性的产生得到一些控制。在免疫能力稳定的情况下，也有利于减少细菌在机体内的定植数量，延缓细菌耐药性的产生。孔令博等[26]在芪归银方对MDR-PA感染大鼠淋巴细胞增殖的影响研究中，发现芪归银方一方面可适度下调感染后超早期T、B淋巴细胞增殖能力，另一方面在与头孢他啶联用时可将抗生素造成的过度抑制的淋巴细胞增殖能力趋于平稳。但中药的“扶正祛邪”能力对PA多重耐药性的调控功能在临床上的相关研究还是不够深入，需要从中医理论的基础上，将中药增强免疫力的能力与逆转细菌耐药性相结合。

综上所述，PA的耐药机制復杂多变，且常由多种耐药机制同时作用产生多重耐药性，所以多靶点的高效逆转PA耐药性的抑制剂是现在研究的重点。PA耐药性愈加严重的现在需要我们重视中药的抗菌、抑菌、逆转PA耐药性作用，通过中药及中药理论的实验实践来拓展更加有效的抑菌剂、逆转耐药剂。中西医结合对PA抗菌及抗耐药的治疗也是我们进一步努力的方向之一，希望可以通过中药来对抗生素抗菌应用时耐药性的产生进行调控，甚至使细菌本身已具有的耐药性逆转。中药抗耐药铜绿假单胞菌的研究还有着在体内研究匮乏、复方药剂研究过少及抗菌和逆转耐药性的机制不明确等相关问题，但相信中药在抗耐药铜绿假单胞菌的进一步研究会为临床抗菌、抗耐药菌减轻抗生素的用药压力，为中药学的发展带来新的思路及研究方法。

[参考文献]

[1]  刘鹰，仲华，吴芳，等.ICU医院感染铜绿假单胞菌的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2015，25（13）：2899-2900.

[2]  何宇婷，黄彬.耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展[J].分子诊断与治疗杂志，2017，9（3）：206-210.

[3]  Fallah F，Borhan RS，Hashemi A. Detection of bla（IMP）and bla（VIM）metallo-β-lactamases genes among Pseudomonas aeruginosa strains [J]. Int J Burns Trauma，2017， 3（2）：122-124.

[4]  崔煦然，刘清泉.铜绿假单胞菌及其相关中药研究进展[J].世界中西医结合杂志，2016，11（11）：1624-1628.

[5]  钟鸣.临床分离48株铜绿假单胞菌的耐药性分析及其耐药质粒检测[J].医学理论与实践，2017，30（14）：2139-2140.

[6]  Taylor PK，Van Kessel ATM，Colavita A，et al. A novel small RNA is important for biofilm formation and pathogenicity in Pseudomonas aeruginosa [J]. PLoS One，2017，12（8）：e0182582.

[7]  何宇婷，黄彬.耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展[J].分子诊断与治疗杂志，2017，9（3）：206-210.

[8]  李蔼文，谭俊青，王康椿，等.5种中药颗粒剂与水煎剂对5种耐药菌株的体外抑菌作用比较[J].检验医学，2015， 30（6）：567-570.

[9]  贺立群，夏飞，王平.三种临床常用中药对临床铜绿假单胞菌分离株的作用研究[J].时珍国医国药，2015（10）：2361-2363.

[10]  黄富贵，张件云，谭敏.涤痰汤对超级耐药菌的临床疗效研究[J].中外医学研究，2015，13（3）：145-146.

[11]  高洁，刘清泉，田金洲，等.芪归银方对耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药作用的影响[J].中医杂志，2012，53（16）：1408-1411.

[12]  张志勇.双黄连注射液对多药耐药铜绿假单胞菌的体外抑制作用分析[J].世界最新医学信息文摘，2015，15（a3）：202，206.

[13]  贾子中.黄连素对烧伤创面铜绿假单胞菌生物膜干预试验及自制中药临床应用观察[D].呼和浩特：内蒙古大学，2015.

[14]  石庆新，吕小萍，於青峰，等.盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用耐碳青酶烯类铜绿假单胞菌的体外药敏实验研究[J].中国现代医生，2017，55（1）：114-117.

[15]  宋鸿，金瑛，王明胜.苦参对铜绿假单胞菌生物膜干预作用的体外研究[J].遵义医学院学报，2015，38（3）：235-238.

[16]  张伟铮，韩菊梅，屈平华，等.银翘散抗铜绿假单胞菌生物膜及与阿奇霉素的协同作用[J].中国热带医学，2015， 15（6）：655-657.

[17]  Fu B，Wu Q，Dang M，et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Formation by Traditional Chinese Medicinal Herb Herba patriniae [J]. Bio Med Res Int，2017， 2017：9584703.

[18]  李亚楠，岑艳灵，孔晋亮，等.黄芩素联合头孢他啶对小鼠腹腔铜绿假单胞菌早期生物被膜感染的体内影响[J].中华医院感染学杂志，2017，27（2）：247-250.

[19]  岑艳灵，陈一强，孔晋亮，等.黄芩苷联合美罗培南对小鼠腹腔铜绿假单胞菌生物被膜感染的作用[J].中国现代医药杂志，2016，18（11）：1-4.

[20]  李君，赵福涛.鱼腥草抗炎作用的新进展[J].医学综述，2014，20（16）：3006-3007.

[21]  程惠娟，杨敏，汪长中，等.鱼腥草素钠增强亚胺培南抗铜绿假单胞菌生物被膜的作用[J].中国中药杂志，2014， 39（2）：296-299.

[22]  张家超，查长森，欧翊.鱼腥草素钠联合聚维酮碘对铜绿假单胞菌生物被膜的作用[J].检验医学与临床，2016， 13（14）：1993-1995.

[23]  Thakur P，Chawla R，Narula A，et al. Anti-hemolytic，hemagglutination inhibition and bacterial membrane disruptive properties of selected herbal extracts attenuate virulence of Carbapenem Resistant Escherichia coli [J]. Microb Pathog，2016，95：133-141.

[24]  Thakur P，Chawla R，Tanwar A，et al. Attenuation of adhesion，quorum sensing and biofilm mediated virulence of carbapenem resistant Escherichia coli by selected natural plant products [J]. Microb Pathog，2016，92：76-85.

[25]  王淋荊，曾建明，鲁洋，等.中药对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵的作用研究[J].分子诊断与治疗杂志，2017，9（6）：401-407.

[26]  孔令博，刘清泉，王兰，等.芪归银方对多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠淋巴细胞增殖的影响[J].中医杂志，2013（18）：1585-1587.

（收稿日期：2018-08-10  本文编辑：罗乔荔）