禽流感病毒疫苗研究进展

周赛赛，贡 嘎，钱雯娴，王一飞，索朗斯珠

（西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000）

流行性感冒(简称流感)，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，是首个实施全球性监测的传染病[1]。流感病毒有甲（A）、乙（B）、丙（C）、丁（D）型，A型流感病毒可分为18个HA亚型、11个NA亚型[2]，A型流感病毒因抗原变异、传染性大、传播快等因素，H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2等亚型流感易造成禽、猪、人等大范围流行，与其他亚型流感相比流行更严重[3]；近期已在人的身上分离出H10N8、H9N2、H7N9、H7N2、H5N6、H5N1、H3N2、H1N1等多个亚型。OIE曾经将高致病性禽流感列为A类动物疫病，我国也曾将高致病性禽流感列为一类动物疫病[4]。自20世纪以来，全球范围内爆发过6次大流感，分别是“西班牙流感”（1918-1919年）由H1N1亚型病毒引起，是人类历史上最大的传染病，几乎同时传遍欧洲、亚洲、北美洲，11个月死亡人数超过第一次世界大战死亡人数的三倍（约5 000万人死亡）；“亚洲流感”(1957-1958年)由H2N2亚型流感引起，首发于我国贵州省，8个月席卷全球，此次流感大流行导致至少100万人失去生命；“香港流感”（1968-1969年）由A型H3N2流感引起，导致全球多于100万人死亡；美国“猪流感”（1976-1977年）由猪H1N1亚型流感引起，导致200余人感染，1人死亡，因四分之一的美国人注射了疫苗，并未造成重大疫情；“俄罗斯流感”（1977-1978年）由1950年H1N1亚型流感的变异株引起，因老年人曾经被原毒株感染过，拥有抵抗力和免疫力，此次青少年发病较高；“2009甲型流感”（2009-2010年）由新型A型H1N1流感病毒引起，导致近2万人死亡[5,6]。在流感预防方面，除防止禽-猪-人流感病毒相互重组外，接种疫苗是目前最有效的方法；因流感病毒亚型较多、易突变，使各国学者在研制疫苗方面困难重重。本文将对国内外不同性质种类的流感病毒疫苗研究进展进行综述。

1 禽流感病毒疫苗的原理及分类

疫苗是一种免疫保护性生物制品，经机体识别后，结合机体后产生免疫机制，诱导机体产生特异性抗体，以此抵抗病原体的侵袭，并产生细胞免疫和体液免疫，或仅一种免疫方式，同时产生记忆性免疫细胞，建立起长期抗感染或减小毒力作用[7]。随着各国学者对疫苗的研究，疫苗可分为治疗疫苗和预防疫苗，根据性质可分为禽流感病毒基因工程疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、载体疫苗、通用疫苗等。

2 禽流感病毒疫苗的研发与应用

2.1 禽流感病毒灭活疫苗

灭活疫苗是用甲醛或其他灭活剂灭活流感病毒鸡胚尿囊液或细胞培养液，再辅加佐剂制成。该灭活苗安全性高、免疫原性强、可制备多价苗、不出现返强和变异现象，是目前被广泛应用的疫苗，主要包括自然分离株和重组病毒研制的疫苗。自2003年起，农业部指定研制了禽流感灭活疫苗，如华南农业大学、扬州大学生物制品研究开发中心等研发的二类禽流感灭活疫苗(H9亚型：SS株），得到农业部批准，其作用安全有效。如今禽流感病毒灭活疫苗得到了有效的发展，如吴姣姣等[8]运用重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗对商品肉鸡进行免疫保护，对免疫商品鸡攻H5亚型和H7亚型禽流感强毒后，发现该灭活疫苗具有良好的免疫效果。章振华等[9]运用鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI)(H9亚型)三联灭活疫苗对雏鸡进行免疫，结果对7～14 d雏鸡免疫保护效果较好。Ali A等[10]运用三价灭活油乳剂疫苗，对感染H5N8亚型高致病性禽流感病毒和毒性基因型VII新城疫病毒的SPF鸡进行免疫，该三价灭活苗具有显著的临床保护作用。

2.2 禽流感病毒基因工程疫苗

基因工程疫苗是将病原的基因片段连接到表达载体，再转染到细胞或真核、原核细胞微生物后得到的产物；或者将病原的毒力相关基因删除掉，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。可分为禽流感病毒基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失或突变疫苗、合成肽疫苗等。

2.2.1 禽流感病毒基因工程活载体疫苗 基因工程活载体疫苗是用分子生物学技术来分离禽流感病毒抗原血凝素或神经氨酸酶等基因，并将抗原插入新城疫病毒、痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒等载体中，构建表达抗原的重组病毒。2005年中国农业部批准生产了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的世界首个二类禽流感-新城疫重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）[11]。因活载体疫苗可以是致病性微生物经基因工程的方法修饰或去掉毒性基因以后，仍保持免疫原性，或是非致病性微生物经基因工程方法使之携带并表达某种特定病原的抗原，产生免疫原性诱导机体产生免疫应答。国内外学者Bertran K等[12]应用H5亚型禽流感病毒重组新城疫疫苗和疱疹病毒疫苗，在接种后丙二醛可增强重组新城疫疫苗产生保护性免疫。Chang P等[13]将流感血凝素（HA）抗原插入鸭肠炎病毒基因组，可用于预防鸭流感病毒感染。虽然，活载体疫苗有很多优势，但活载体疫苗有可能保存一定活力、对保存和运输要求较高。

2.2.2 禽流感病毒样颗粒疫苗 流感病毒样颗粒疫苗是将流感病毒的抗原基因克隆到杆状病毒系统内，经细胞表达后自组装制成，可模拟病毒的免疫原性，能诱导机体产生体液和细胞免疫，且病毒样颗粒不含病毒基因组和相关抗原，不能在细胞内复制，无感染性，适用人群广泛。为此国内学者童彦军[14]潘学等[15]利用H7N9、H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因，建立了一种H7N9、H9N2亚型流感病毒颗粒疫苗制备的方法，小鼠实验表明对流感病毒效果良好且可产生交叉免疫反应。

2.2.3 禽流感病毒基因工程亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗是通过基因工程方法取出编码保护性抗原的基因，将基因和质粒等载体重组，再转化至受体菌或细胞中，获得大量保护性肽段，然后再加入适量疫苗佐剂制成。亚单位疫苗所具有的优点不仅安全性好，而且在刺激免疫保护力上具有很强的作用，对人类、动物和生态环境无潜在危害。我国学者范文辉等[16]周陈陈等[17]将H5、H7亚型流感病毒HA蛋白基因，经筛选得到表达重组菌，获得浓缩纯化的目的蛋白，加佐剂研制成H5、H7亚型亚单位疫苗，经免疫SPF鸡试验，表明该疫苗具有良好免疫效果。Flood A等[18]利用冷冻干燥技术开发了两种干燥型H1N1流感亚单位疫苗，经免疫小鼠试验，表明该疫苗具有安全免疫原性。在佐剂的利用方面，Chen T H等[19]使用一种新型PELC/CPG佐剂开发重组H7N9亚单位疫苗，经肌内免疫BALB/C小鼠后，用这种佐剂配制的重组H7HA蛋白在血清中引发更高的IgG和病毒中和抗体，在脾脏中诱导更多T细胞分泌抗体和IFN-γ，并对小鼠提供更好的保护作用。为了优化免疫方式Dhakal S等[20]用10种高度保守的B和T细胞表位肽的脂质体纳米颗粒（R＜200 nm）为基础，用尿酸单钠（MSU）晶体作为佐剂的亚单位流感疫苗，对H1N1亚型流感感染进行保护性免疫保护，并以鼻内喷雾的形式给猪接种疫苗，表明保护了猪免受流感引起的发热和肺炎的损害。但是亚单位疫苗缺点在于免疫原性差、成本高、抗体持续时间短、有些甚至是半抗原、需要与蛋白载体偶联后使用等。

2.2.4 禽流感病毒核酸疫苗 核酸疫苗是利用分子生物学、免疫学、生物化学等方法研制成的DNA疫苗或RNA疫苗；将可表达保护性免疫原基因(DNA或RNA)导入动物体细胞内，诱发机体宿主细胞通过合成抗原蛋白，诱导宿主产生免疫应答，核酸苗的研究以DNA疫苗为主，DNA疫苗因不需要任何化学载体而又叫裸疫苗。因DNA分子较稳定、与传统疫苗相比安全、不用加佐剂、产成本较低等优点，我国学者贾云慧等[21]经研究以欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白作为靶抗原，制备DNA疫苗，经免疫BALB/c小鼠表明产生高水平的HI和VN抗体，对同源欧亚类禽型H1N1猪流感的感染有完全保护作用，对异源pdm H1N1/2009猪流感的感染也有叉免疫保护效果。Yao Y等[22]研究了H1N1亚型流感病毒M2蛋白，N端胞外区为靶抗原，研发了M2E DNA疫苗，经免疫小鼠发现这两种疫苗可保护人类免受H1N1亚型病毒的致命感染。RNA疫苗可分成两类型，一种是常规下的mRNA疫苗，一种是自我扩增的mRNA疫苗。国外学者Norbert P等[23]使用核苷修饰和纯化的编码全长流感病毒HA的mRNA，该病毒以脂质纳米粒形式配制，经免疫小鼠、兔子和雪貂，是一种有效、具有广泛保护作用的流感病毒候选疫苗，表明在注射部位和淋巴结中天然免疫反应的强烈激活，mRNA疫苗可以与灭活病毒的疫苗竞争，甚至在功能性抗体和T细胞反应方面更优越。经过我国科研工作者的不断努力，2018年中国农村农业部批准了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位的首个一类禽流感DNA疫苗（H5亚型，pH5-GD）的生产。

2.3 禽流感病毒减毒活疫苗

减毒活疫苗是禽流感病毒经处理后，毒性亚单位结构改变，但结合亚单位的活性保持不变，使疫苗保持了抗原性且达到减毒的目的。随着基因工程技术的发展，因减毒活疫苗与灭活疫苗相比可诱导体液免疫和细胞免疫、在机体内长时间起作用、而只需接种一次、无需加佐剂、价格低廉等优点。国内外学者刘梅等[24]Mamerow S等[25]运用禽流感病毒NS1基因缺失或突变的减毒活疫苗，对猪、小鼠或蛋鸡进行免疫免疫，结果表明小鼠和猪既没有出现临床症状且对鸡有良好保护，也没有检测到病毒复制。Wan Z等[26]利用A型H3N2和H1N1流感病毒和两个B型流感病毒抗原谱系，制成的竞争性减毒活流感病毒疫苗配方，可提供有效的保护。但减毒活疫苗缺点是有一定残余毒力、可能有“毒力返祖”现象、产品的分析评估困难、保存和运输等条件高等；因此，目前我国还未有被批准的禽流感病毒减毒活疫苗。

2.4 禽流感病毒通用疫苗

流感通用疫苗原理是破坏流感病毒各亚型共有的蛋白，蛋白为HA、M2，因蛋白几乎未发生变异，为研发提供了充分的理论基础，该疫苗对病毒各亚型都具有一定的交叉保护性，流感病毒防控方面具有重要意义。因通用疫苗是人们最想得到的理想疫苗，仅有个别国外学者对其研究，如Rowell J等[27]利用A型流感病毒相对保守的NP和M2抗原，研究了一种通用流感疫苗，该疫苗经小鼠鼻内给药试验，该疫苗对有不同呼吸道感染史的人群也有效。Sun W等[28]利用A、B型流感病毒，将A型流感血凝素的相应序列替换B型流感血凝素的主要抗原位点，产生镶嵌B血凝素，并将其表达可溶性三聚体蛋白，研制了一种新的基于镶嵌血凝素的通用B型流感病毒疫苗，结果该疫苗对同源和异源性B型流感病毒株产生交叉保护作用。通用禽流感疫苗的优点在于此疫苗可预防所有常见流感，保护时间长等。

3 小结和展望

自20世纪30年代，各国学者开始研制流感病毒疫苗，在过去几十年中，随着新技术的发展和各国学者对流感病毒研究的不断深入，从最初2003年批准的单价禽流感病毒灭活苗到2018年基因工程DNA疫苗的批准，禽流感病毒疫苗已经获得较快的发展。通过对中国农业农村部的公告统计，自2003年至2018年我国部门陆续批准了H5和H9亚型不同毒株的单价和二价禽流感灭活疫苗；在2003年我国首次出现新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗；随后十年间我国不断出现三联、四联重组灭活疫苗；直到2014年后我国未见四联苗的批准；我国科研工作者开始着眼于单价灭活疫苗、二价灭活疫苗、二联和三联灭活疫苗的研发，如我国的三联苗，通过对肉仔鸡免疫鸡新城疫+传染性支气管炎+禽流感三联灭活疫苗，对H9亚型禽流感的免疫效果达100%；随着细胞源禽流感病毒在质量、稳定性、含量和纯净性等方面突出的优点，近两年我国对（H5+H7）亚型禽流感病毒重组二价灭活疫苗毒株也倾向于用细胞源毒株。

由于流感病毒亚型较多，基因重组等问题，虽已经研发出各种流感病毒疫苗，但疫苗在临床应用中仍然有较多缺点，为此各国学者也在积极研发高效、安全、低成本的新型流感病毒疫苗，新型流感病毒疫苗将在人类防控流感过程中发挥重要作用。通用疫苗是人们期盼多年的疫苗，但提高该苗对变异株的广谱能力是一个难题，从目前研究结果来看，它还很难进入实用，随着疫苗生产技术的发展，相信在不久的将来会研究出安全性好、免疫原性高的流感疫苗。