赖氨酸特异性去甲基化酶1功能及与肿瘤关系的研究进展

陈江 李雪松 王子卫 杜吉义 综述 丁杰 审校

(毕节市七星关区人民医院 普通外科，贵州 毕节 551700)

1942年，奥地利发育生物学家Waddington率先提出表观遗传学概念，认为表观遗传是基因型产生表型的过程[1]。表观遗传学(epigenetics)是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传的改变，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA(Micro RNA)等。而组蛋白共价修饰作为一种重要的表观遗传模式，包括乙酰化(acetylation)、磷酸化( phosphorylation)、甲基化(methylation)、泛素化(ubiquitination)、SUMO化(small ubiquitin-related modifier)、ADP-核糖基化(ADP-ribosylation)等[2]。人们对组蛋白的功能研究展开了广泛的研究。我们针对组蛋白去甲基化酶赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSDl)的结构、功能以及在肿瘤领域的研究进展作一综述。

1 LSD1的结构、功能

LSD1，胺氧化酶家族成员之一，也称为KIAA0601、KDMl、AOF2、BHC110、p110b等，从酵母到人类均非常保守。Tower 结构域和c 端的胺氧化酶结构(amino oxidase like domain，AOL)。Tower结构域是由从c端胺氧化酶结构域向外伸出的两个很长的平行α螺旋形成，而胺氧化酶结构域又包括黄素腺瞟呤二核苷酸(Flavin adenine dinulcleotide，FAD)结合结构域和催化活性中心两个部分，它们是组蛋白底物的结合位点，在一级结构中Tower结构域把胺氧化酶结构域分成两个部分，通过Tower结构LSD1能够与其他蛋白，如CoREST蛋白相互作用，有研究报道通过重组缺失Tower 结构的LSD1蛋白证实，Tower 结构对LSD1的活性起着决定性的作用。FAD催化LSD1氧化反应产生一个甲醛和一个去甲基化的赖氨酸残基脱去甲基基团，可以特异脱去组蛋白H3K4和组蛋白H3K9的二甲基和一甲基修饰，在体内则可以去除H3K9的二甲基和一甲基修饰，调控靶基因的表达[3-4]。而H3K4三甲基修饰的去除则由另一类含有JmjC结构域的蛋白家族完成，JmjC结构域的蛋白家族依赖Fe(II)和α-酮戊二酸为辅因子催化氧化反应去除甲基基团，其家族成员可对H3K9、H3K27、H3K36 等多个位点行脱甲基化[5-6]。目前研究证实，H3K9、H3K27的甲基化修饰往往和基因转录抑制相关，而H3K4、H3K36和H3K79的甲基化修饰则常常促进基因转录激活[7]。LSD1主要通过以下几种方式来调控基因的表达：(1)CoREST的SANT2结构域与靶基因作用后，H3K4脱甲基化，触发转录抑制；(2)LSD1与AR/ER作用后，导致H3K9脱甲基化，触发激活激素受体依赖的基因转录[8-9]；(3)LSD1作用H3K4的脱甲基化，使得DNA甲基转移酶的正调控因子DNMT3L能够与未甲基化的K4位点结合，促进DNMTs的表达上调，造成DNA再甲基化(Denovomethylation)，最终触发基因转录抑制[10]。

2 LSD1活性的调控

目前的研究表明，LSD1以组蛋白去乙酰化酶复合物的形式存在于体内，CoREST、BHC80、HDAC1/2、BRAF等蛋白在此复合物中与LSD1形成共抑制复合物，从而精细地调控LSD1的活性[11]。LSD1不能以核小体作为底物，只有LSD1与含有SANT结构域的RE-1元件辅助沉默因子(CoREST)结合后才能以核小体为底物使组蛋白上的H3K4Me去甲基化，CoREST与LSD1的结合能使LSD1不被蛋白酶水解，使LSD1趋于稳定，并在与染色质结合后招募LSD1[12-13]。研究发现，小类泛素修饰因子(SUMO)可与CoREST1的SIM结构域相互作用后，上调LSD1活性，SUMO结合除去后，LSD1抑制调控的靶基因表达上调，靶基因启动子区的LSD1降低[14]。此外，组蛋白去乙酰化酶调控着LSD1的组蛋白去甲基化酶活性，抑制组蛋白去乙酰化活性后，LSD1的去甲基化酶活性也被抑制，例如，组蛋白H3的过乙酰化能抑制LSD1的去甲基化酶的活性，LSD1的活性也可以被H3K9的乙酰化显著降低，并能被组蛋白H3第10位丝氨酸(H3S10)的磷酸化灭活[15]。一个组蛋白去乙酰化酶复合物中常常包含LSD1、CoREST以及BHC80复合体。在体外BHC80能抑制LSD1的组蛋白去甲基化酶活性，同时也能抑制细胞中LSD1-CoREST复合物的核小体去甲基化酶活性[16]。激活雄激素受体依赖的基因在LSD1与雄激素受体结合后开始表达，LSD1对H3K4的特异性因为雄激素受体改变为对H3K9的特异性[17]。如在人的前列腺癌细胞中，雄激素受体依赖的基因表达因为LSD1与雄激素受体相互作用而被激活，RNAi介导的LSD1基因敲除后，导致上调H3K9甲基化水平以及遏制相应的雄激素受体依赖基因，证实LSD1能借助H3K9去甲基化而实现激活基因转录[18]。研究[19-20]证实，LSD1的活性也受到miR-137的调控。很多文献已验证miR-137的靶基因包括LSD1、Cdc42等。在结肠癌中，miR-137被认为是肿瘤抑制基因，miR-137的表达通常因为启动子区域CpG岛超甲基化修饰而被下调[21]。miR-137的下游靶基因LSDlmRNA的表达受到miR-137的抑制，转染miR-137前体序列可以阻遏结肠癌细胞的生长繁殖[22]。另一方面，核受体TLX可以将LSD1招集至miR-137基因启动子区域，对miR-137的表达行负向调控，达成一个调控反馈通路[23]。

3 LSD1在肿瘤中的研究进展

以前的观点认为，肿瘤的发生是基于基因突变，但近年来研究证实，表观遗传机制在肿瘤的发生发展过程中发挥着举足轻重的作用。表观遗传机制的异常可调控基因转录。近年来的研究发现，LSD1也可以催化细胞内非组蛋白去甲基化来调节细胞内生化过程。LSD1可通过催化抑癌蛋白p53羧基末端二甲基化的K370位点而使之脱甲基化，导致共激活蛋白53BP1的Tudor结构域未能与K370位点作用，进而阻止p53与53BP1相互结合，从而导致p53信号通路的传递中断，调控着p53的生物学活性，使细胞增殖失控[24]。LSD1可能会因为缺失导致部分细胞停滞在G2/M期，进而促进细胞相变和增值，提示着它的过表达可能会促进肿瘤的形成[25]。研究[26]发现，Mi-2/核小体重组和脱乙酰基酶复合物(NuRD)的核心成分之一为LSD1，与细胞生长、存活、转移、侵袭相关的多种基因的启动子区域均可以和LSD1/NuRD复合物锚定，如E-cadherinsnail-slug-EMT以及肿瘤侵袭的关键信号通路TGF-β；该研究还发现，LSD1可抑制乳腺癌细胞的侵袭及转移能力，LSD1反向调节TGF-β1信号通路，从而调节细胞的增殖、上皮间充质转化等过程。研究发现，E-cadherin编码基因CDH1的缺失或异常表达主要是通过EMT途径实现肿瘤细胞的侵袭转移。EMT在恶性肿瘤的转移过程中发挥关键的扳机作用，在EMT过程中上皮细胞失去自身特性与极性转化为具有间质表型细胞类型。在此生物学过程中，细胞间粘附能力因为上皮细胞的成纤维细胞样特性、细胞极性消失而减退[27]。同时E-钙粘蛋白、角蛋白等上皮表型逐步丧失，而N钙粘蛋白、波形蛋白等间质表型表达增强[28]。启动EMT的关键转录因子有Snail、Slug.Twist、ZEB1、ZEB2等。Wnt/β-catenin、Notch、TGF-β、PI3K等EMT相关的信号通路在信号分子的作用下被激活，转录因子的表达丰度或活性相继发生改变，启动EMT信号通路，随之触发肿瘤细胞转移生物学机制[29-32]。赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)在转录因子Snail/Slug介导的EMT过程中扮演着必需的角色，LSD1的缺如，转录因子将不能抑制E钙黏蛋白的表达，Snail/Slug无法独立阻遏E-cadherin基因的表达，其对E-cadherin的抑制作用是通过LSD1对E-cadherin启动子区域组蛋白的表观遗传修饰来实现的[33-35]。Snail/Slug蛋白分子可以靠N末端的SNAG分子挂钩结构，召集LSD1和CoREST形成的络合物，与靶基因的启动子区域的E-box序列结合，来发挥LSD1的活性，脱去靶基因启动子区域组蛋白H3K4的二甲基(H3K4me2)相一甲基(H3K4me)修饰，遏制靶基因的表达。E-cadherin蛋白表达下调的可能因素包括CDH1基因突变、DNA甲基化修饰和CDH1基因突转录抑制[36-37]。针对LSD1对结肠癌细胞的侵袭转移能力影响的分子机制，多个研究发现在结肠癌组织中LSD1呈现出高表达。 有学者开展了一系列前期研究，结果显示，在108例结肠癌组织中LSD1的表达率明显高于正常结肠粘膜上皮组织，阳性率高达66.7%。LSD1与结肠癌TNM分期、远处转移呈正相关，LSD1高表达的结肠癌患者预后较差，由此推测LSD1在结肠癌细胞的侵袭转移过程中扮演了十分重要的角色[38]。丁杰等[39]进行的体外细胞实验显示，靶向敲除LSD1基因能明显抑制结肠癌SW620细胞的增殖能力，使其侵袭性下降，增高细胞凋亡率；同时发现，在靶向沉默LSD1基因后，能下调SW620细胞中LSD1的mRNA及蛋白水平，而明显上调E钙黏蛋白的mRNA及蛋白水平，因此推测LSD1可能参与EMT途径启动结肠癌的转移。张元元等[40]通过检测52例结肠癌组织中LSD1的表达水平，发现LSD1在结肠癌组织中的表达率明显高于癌旁组织；而且LSD1的表达与临床病理指标，即分化程度、淋巴结转移等具有明显相关性，差异有统计学意义，下调LSDl表达可以阻遏结肠癌细胞的迁移能力。研究发现，LSD1抑制剂与DNA甲基转移酶抑制剂共同在结肠癌细胞HCT116中使用，结果显示单独使用LSD1剂抑制后抑癌基因SFRP会再表达，两者联合使用则能够明显诱导已经沉寂的抑癌基因SFRP2再表达[41]。P53及miR-137等抑癌基因在参与结肠癌侵袭、转移过程中仍具有重要地位，LSD1的活性受到miR-137的调节。在结肠癌细胞中，miR-137的表达因为启动子区域CpG岛超甲基化而下调，miR-137则靠下调LSD1的表达而间接阻遏结肠癌细胞的发生发展[42]。LSD1对E-cadherin启动子区域组蛋白的表观遗传修饰来实现对E-cadherin基因的抑制，破坏细胞黏附能力，推动EMT的进程，促进了细胞的侵袭转移[43]。

4 LSD1抑制剂的研究进展

根据与FAD相互作用的不同机制，LSD1抑制剂可分为两大类别：不可逆型LSD1抑制剂及可逆型LSD1抑制剂。苯环丙胺及其衍生物为不可逆型LSD1抑制剂。此类化合物通过与FAD区域结合，形成环状中间体形成不可逆转的加合物；LSDl抑制剂不与FAD形成上述加合物形式则为可逆型，此过程可以发生逆转。因为LSD1与胺氧化酶结构上同源，并且有45%的相同序列的催化区域[44]，这种结构上的相似性使得人们开始针对MAO抑制剂对LSDl抑制作用进行研究。Lee.MG等[45]研究发现，苯环丙胺(tranylcypromine，1)、优降宁(pargyline，2)、苯乙肼(phenelzine，3)等MAO抑制剂能够抑制LSD1活性，但由于抑制活性较小，选择性差等原因，不能用作特异性的LSD1抑制剂。在此结构基础上，一系列选择性更好的具有苯环丙胺骨架的衍生物被开发，Ueda等[46]设计特异性更强的化合物5、6其对LSD1的抑制活性比苯环丙胺提高了400～1 100倍；并且该研究团队还设计并合成了N-烷基化的化合物7，酶抑制活性提高了6倍[47]。

由于LSD1能够识别组蛋白 H3N 端21个氨基酸多肽，2010年Culhane等[48]设计并合成了一系列多肽类LSD1抑制剂，发现非时间依赖性LSD1抑制剂—多肽化合物1，IC50值为(15.6士1.7)。Kakizawa等[49]根据组蛋白 H3上的氨基酸序列，设计了对LSD1具有选择性抑制作用的一类含有苯环丙胺结构的21肽，化合物22(IC50= 0.148 μmol·L-1)显示了最强的抑制效果。Tortorici等[50]基于Snail的氨基酸序列设计了能竞争性抑制LSD1活性的具有6个氨基酸的小肽，而且具有抗增殖效应。

Sorna等[51]通过高通量虚拟筛选的方法获取了一类具有苯甲酰肼结构的强效LSD1抑制剂，通过结构优化设计并合成了具有很强LSD1抑制活性的化合物34(IC50= 13 nmo1·L-1)，能可逆并特异性地与LSD1结合，对乳腺癌和结直肠癌细胞系具有显著抗增殖作用。运用传统小分子化合物调控LSD1的活性来调节肿瘤的发生、进展是目前LSD1抑制剂研究的热点方向。但现今发现的LSD1抑制剂对酶的抑制选择性及活性较差，因此，设计合成高效、高选择性小分子LSD1抑制剂成为今后研究的目标。