女性盆底修复组织工程补片的研究现状

2019-03-18吴晓彤王建六孙秀丽

国际妇产科学杂志 2019年4期

吴晓彤，王建六，孙秀丽

盆底功能障碍性疾病（pelvic floor dysfunction，PFD）作为中老年妇女的常见病、多发病，发病率高达30%～50%[1]，主要表现为盆腔器官膨出、压力性尿失禁、排便障碍等。手术是PFD主要的治疗方式，临床上常用的方式有自体组织修复手术和网片植入性手术。自体组织修复手术复发率较高，高达30%左右[2]。植入性手术较常用的合成补片如聚丙烯补片，其力学性能好、复发率低，但其不可降解、组织相容性差，造成一系列术后问题，如补片侵蚀、暴露、感染等[3]。生物源性补片组织相容性好，但力学性能差，植入体内解剖复位效果差，降解速度快于新生组织的形成速度，易造成盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse,POP）复发。因此，针对盆底支持组织的修复设计并研发一种力学性能满足盆底支持要求、生物相容性好并能在一定程度上促进组织修复的生物补片，是临床补片植入治疗PFD的迫切需求，组织工程技术应运而生，现针对女性盆底修复的组织工程研究现状进行概述。

1 种子细胞

种子细胞是组织工程的前提，其来源广泛，包括自体、异体、异种组织等，免疫排斥反应限制了种子细胞的多向取材，自体细胞则是一个良好的选择。女性盆底修复工程的种子细胞来源包括成纤维细胞和干细胞。

1.1 成纤维细胞成纤维细胞是分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重要细胞，可取材于阴道壁及韧带结构等。将成纤维细胞种植在聚丙烯补片及一些生物源性补片上，利用其在植入部位及补片间分泌的ECM形成一种胶原膜，可以改善补片的生物相容性，减少并发症等[4]。有研究将体外培养的小鼠成纤维细胞种植在聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）支架上构建组织工程补片，成功修复了小鼠的腹壁缺损[5]。提示成纤维细胞在组织工程中可以通过分泌胶原合成ECM来达到修复的目的。

1.2 干细胞干细胞是根据其再生能力和分化成一种或多种细胞类型的能力来定义的。人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）是从囊胚获得的，具有高度可塑性和快速增殖能力，然而移植后的免疫排斥反应需要引起重视，且移植涉及的伦理问题也限制了其在盆底疾病治疗中的应用。多能干细胞包括间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），能够分化成多种细胞类型，来源丰富（骨髓、脐血、脂肪或肌肉），在减轻炎症反应、促进组织修复再生、影响局部组织的生长微环境中具有重要作用[6]。

1.2.1 骨骼肌源性干细胞 Ho等[7]提出基于干细胞疗法治疗PFD，利用小鼠骨骼肌源性干细胞，将其种在由猪小肠黏膜下层脱细胞基质（porcine small intestine submucosa，P-SIS）上，植入大鼠阴道后，骨骼肌源性干细胞分化为平滑肌细胞，成功促进了阴道组织的修复。Boennelycke等[8]将新鲜的骨骼肌纤维片段种植到可生物降解人工合成支架中，构建大鼠腹壁缺损模型，8周后，新的横纹肌组织长入，支架降解吸收。在泌尿系统疾病动物模型中，注射骨骼肌源性干细胞后，新的神经支配肌纤维形成，平滑肌细胞、疏松的间质组织和血管形成[9]。

1.2.2 MSC MSC易从骨髓或脂肪组织中分离培养和扩增，已广泛应用于损伤组织的修复和再生[10]。动物疾病模型中利用骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）和脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC）修复尿道括约肌治疗压力性尿失禁[9，11]。Zou等[12]将种植BMSC的吊带植入压力性尿失禁大鼠模型中，成功地改善了大鼠尿失禁的症状。Dolce等[13]研究证明，通过BMSC建立细胞生物层降低了大鼠腹腔粘连程度，从而改善了补片材料的生物相容性。MSC具有多能性，可分化为不同的谱系，如骨、软骨、脂肪细胞、肌腱、韧带和平滑肌。分化方向由植入位点的微环境驱动，通过这种方式，自体MSC，特别是容易获得的ADSC，可能是POP修复的理想选择。

2 生物支架材料

大多数哺乳动物的细胞需要黏附基质提供支持，生物支架材料提供了这样一种三维立体的基质结构。组织工程的生物支架材料需满足以下条件[14]：①生物相容性好，利于细胞黏附、增殖，无毒性，无免疫原性；②生物可降解性；③具有一定的机械强度并诱导组织再生；④一定的孔隙率及适当大小的孔径；⑤性质稳定。应用于PFD的组织工程生物支架材料包括人工合成材料和天然生物材料。

2.1 人工合成材料包括人工合成聚合物，例如聚乳酸（PLA）、PGA 及其共聚物（PLGA）等，其天然无毒，产物为乳酸和乙醇酸，通过机体代谢清除[15]，已成功应用于尿道组织生成和膀胱置换[16-17]。聚己内酯（PCL）是另一种基于羟基烷酸的合成高分子化合物，因其具有生物相容性好、免疫原性低、可在生理条件下水解等优异性能，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准临床使用，在组织工程中备受关注[18]。但合成高分子生物材料仍有不足之处，如某些种类的聚合物可能会产生酸性降解产物，从而改变其周围组织的pH值，进而影响细胞的行为和生存，并引起不良组织和炎症反应[19]。此外，由于缺乏生物功能域，不能使细胞黏附、长入。所以通过对合成高分子生物材料进行优化，将生物活性区域耦联到支架上面，或者通过表面添加生物活性剂，从而能够生产具有生物活性的仿生支架，具有促进细胞黏附，并增强干细胞定向分化的功能[20]。

2.2 天然生物材料天然生物材料通常可分为3类：蛋白质（如胶原蛋白、丝素蛋白、明胶、纤维连接蛋白、角蛋白等）、多糖生物材料（如透明质酸、纤维素、葡萄糖、藻酸盐、软骨素、甲壳素及其衍生物壳聚糖等）和组织源性生物材料。以蛋白质为基础的生物材料通常从动物和人类来源获得，而以多糖为基础的生物材料主要来自藻类，如琼脂和海藻酸盐，或从微生物来源，如葡聚糖及其衍生物[21]。组织源性生物材料如脱细胞基质补片，是一种新型的同种异体生物源性补片。在脱去细胞去除免疫原性的同时，保留了细胞黏附和增殖所需的完整结构。其缺点是机械强度不足及降解较快，易导致POP复发[22]。多年来研究者对去细胞化方法进行了优化，在保持ECM完整的同时完全去除细胞成分并保留生物活性因子[23]，一定程度上保持了其功能活性，当作为组织工程产物植入病灶，这些生物活性物质就会释放出来，并在细胞调控中发挥天然作用，从而为特定的ECM提供修复和再生必需的信息[24]，指导细胞生长、增殖和分化。因此，脱细胞ECM作为一种“现成的”和免疫兼容的生物材料在组织工程中越来越受到关注。

3 生物活性因子

现代的观点也将种子细胞、生物支架材料、生物活性因子作为组织工程的三大要素。这些生物活性因子可能通过启动激活干细胞来诱导分化、增强再生过程[25]。常见的与PFD相关的生物活性因子包括雌激素和生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）等。研究表明，雌激素通过影响成纤维细胞增殖和胶原合成来促进盆底组织修复[26]。Takacs等[27]研究表明，雌激素在体外促进阴道平滑肌细胞生长，但抑制了弹性蛋白的产生。Manodoro等[28]在大鼠模型中发现雌激素增加了补片修复的能力，但降低了植入部位的组织抗拉伸强度。因此雌激素的治疗效果是有争议的。Hormozi等[29]研究证明bFGF明显促进BMSC向成纤维细胞方向分化，并明显增加韧带和肌腱特异性ECM和细胞骨架成分的表达。Jia等[30]将bFGF作用于成纤维细胞，发现成纤维细胞增殖明显加快，且胶原蛋白的表达量明显增加，提示bFGF可以改变盆底组织的生长微环境从而促进组织修复再生。TGF-β1能促进ECM分泌形成并抑制其降解，刺激细胞及ECM中大多数胶原蛋白基因mRNA水平提高和蛋白产物增加。

4 组织构建

组织构建技术分为体内构建和体外构建[14]。体外构建是指将种子细胞悬液与生物支架在体外环境共培养，利用生物支架的生物特性及表面活性因子的驱化使细胞黏附，长入并分泌ECM，以ECM逐步积累形成的特定组织植入体内，完成组织修复，此方法操作简单、易控制，但周期长、细胞种植不匀、新生组织力学强度欠佳，导致植入失败或复发。体外构建是指将体外培养的种子细胞与支架混合直接植入体内，体外培养周期短，支架强度可控，无需特殊培养条件，是一种常用的构建方法，但受植入部位局部微环境影响治疗效果。3D打印技术的出现对支架的制作和细胞的分布都有很好的控制作用，是组织工程新兴的热点研究方法，与其他组织构建方法相比，具有精度高、成本效益好、简单易行、细胞分布可控性好等优点[31]，包括挤压法、喷墨法、立体石版法、激光辅助生物打印法等，可成功地将种子细胞构建到生物支架上。