干细胞在子宫内膜损伤后修复的研究进展

韩笑，黄晓武

子宫内膜损伤后常导致再生障碍引发月经减少、闭经、女性不孕或反复流产等。目前促进子宫内膜损伤后修复的方法很多，但对于中重度损伤后促进内膜再生的方法仍十分有限。了解子宫内膜的基本结构与损伤后的病理生理变化，探索更加安全、有效的治疗方法，才能帮助这类患者改善临床症状，获得良好的生育结局。干细胞作为具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在组织修复和再生领域已有很多成功的报道，直接或间接递送干细胞促进子宫内膜损伤修复已成为新的研究方向。

1 子宫内膜修复

1.1 子宫内膜生理性修复 育龄期女性的子宫内膜具有高度再生修复能力。子宫内膜组织根据其功能、结构主要分为外部功能层和内部基底层两部分，功能层由腺体组织和结缔组织构成，基底层主要由基质构成。在月经期，功能层和一小部分基底层会发生周期性脱落，此时子宫内膜上皮细胞的修复为非激素依赖性，原有上皮细胞脱落，腺体结构重塑，新的上皮细胞由周围基质中子宫内膜干细胞分化而来，修复过程不存在细胞增殖。而上皮细胞修复完成后，间质细胞及血管的修复则为激素依赖性，在随后的增殖期、分化期，子宫内膜将随着体内雌、孕激素的变化进行修复，即通过上皮、间质细胞的增殖和分化，成纤维细胞重塑细胞外基质，内膜血管重建进而达到完全无痕化修复[1]。基底层虽然在月经期几乎不发生脱落，不受月经周期中卵巢激素变化的影响，但其完整性对内膜修复至关重要。正常情况下，子宫内膜在增殖期逐渐增厚，直至排卵时厚度可达7～14 mm，随后向分泌期转化，为胚胎着床创造适宜的条件。

1.2 子宫内膜损伤后修复

1.2.1 宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）形成 各种病理性因素如宫腔操作、子宫缺血、感染等均可造成子宫内膜损伤。各种病理性因素破坏子宫内膜屏障，导致宫腔表面缺乏上皮细胞覆盖、间质裸露、胶原沉积、炎性细胞浸润、组织水肿等，从而造成子宫内膜纤维化，形成IUA。宫腔镜下，粘连可分为内膜粘连、肌纤维粘连和结缔组织粘连。基底层损伤后，病理学上表现为：子宫内膜腺体稀疏、无活性或囊样扩张，间质被纤维组织大量替代，功能层与基底层不能辨别，由对雌激素无反应的单层上皮细胞构成，常缺乏血管。

导致IUA的原因中约90%是由于刮宫术所致，包括自然流产刮宫、人工流产术及产后清宫，且随着刮宫次数的增加，子宫内膜损伤程度越重。损伤因素破坏子宫内膜基底层和子宫内膜血运，引发炎症反应，抑制子宫内膜再生。损伤后的子宫内膜上皮层修复障碍，间质裸露导致纤维活性增加，促纤维化细胞因子分泌增多，成纤维细胞过度增生，进而导致血管再生障碍和子宫内膜增殖障碍，纤维细胞沉积形成瘢痕，形成损伤后修复过程。损伤后的子宫内膜上皮细胞再生延迟，子宫内膜腺体数量减少，呈无活性或囊性扩张，子宫内膜容受性下降，影响受精卵或胚胎的植入及着床，引发女性不孕或反复流产[2]。

1.2.2 薄型子宫内膜或难治性子宫内膜 子宫内膜损伤的患者可以表现为IUA，但在临床中也有部分患者内膜损伤后宫腔形态尚且正常，未见缩窄或粘连形成，仅表现为内膜较薄、子宫内膜容受性差。通常认为胚胎着床的理想条件是在排卵前子宫内膜厚度达到8～12 mm，但对于着床所需的内膜厚度尚无统一标准。内膜厚度在5～15 mm的范围内均有妊娠案例报道，甚至有内膜厚度小于5 mm仍成功生育的案例。但一般认为内膜厚度至少应该＞7 mm，而一些患者内膜厚度始终小于7 mm，故也将这类受损的子宫内膜称为薄型子宫内膜。2003年Sharkey等[3]提出“难治性子宫内膜”的概念，表示这类内膜对激素反应较差，厚度很难增长，在辅助生殖移植中不易成功，目前尚无有效方法可以促进此类患者的子宫内膜增厚。虽然难治性子宫内膜发病率不高，大约为2.4%，但却严重影响女性生育能力，因而成为现代医学的巨大挑战[4]。

重建正常的子宫结构和恢复子宫功能是子宫内膜损伤患者的治疗目的。宫腔镜手术可以帮助子宫恢复正常的宫腔形态，暴露被粘连封闭的内膜，使其有向周围生长的机会，宫腔镜手术也是目前公认的诊断和治疗IUA的金标准[5]。宫腔镜术后也常使用一些辅助治疗促进内膜修复[6]。目前用于促进子宫内膜损伤修复的方法主要涉及两个方面：一是促进子宫内膜再生修复，例如雌激素[7-9]的治疗，可刺激子宫内膜生长，促进上皮细胞尽快覆盖裸露的间质；二是增加子宫内膜血流，如阿司匹林及西地那非[10]等。但对于中重度粘连的患者，内膜再生障碍、术后粘连复发等仍不能有效避免。

2 干细胞用于子宫内膜损伤后修复的研究进展

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，分为胚胎干细胞及成体干细胞。胚胎干细胞是从囊胚的内细胞团中分离的细胞，具有无限的自我更新能力，并可分化为三胚层的细胞，但由于受到伦理等各方面的限制，获取大量高活性的干细胞十分困难，且其本身具有致瘤性、免疫排斥，更加限制了在临床中的应用。成体干细胞是来源于成熟组织的多能干细胞的统称，现已在多种组织器官中被发现，特别是间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），具有多向分化潜能的同时，还有低免疫原性，具有巨大的应用前景[11]。

干细胞疗法已在多学科中进行了广泛探索，并成为组织修复和再生的希望。目前干细胞疗法已应用于多种疾病的研究，如退行性疾病、心肌损伤和骨组织再生等，在妇产科疾病特别是Asherman综合征和薄型子宫内膜的治疗中也有巨大的潜能。直接或间接递送干细胞促进子宫内膜损伤修复已成为新的研究方向，不少研究发现移植不同来源的干细胞对子宫内膜损伤修复具有积极影响，如减少纤维化面积、增加子宫内膜厚度及腺体数量、刺激血管生成以及改善妊娠结局等。目前对于子宫内膜损伤的治疗主要通过静脉或宫腔注射移植干细胞。但对于静脉注射的安全性及如何提高干细胞治疗技术中移植细胞的归巢率及存活率尚不能明确。也有研究选择新型生物支架如水凝胶等进行干细胞的递送，而干细胞与这些支架的组织相容性也有待确定。

子宫内膜损伤后修复的研究中发现，干细胞移植数量有限，移植后的细胞增殖率极低，也就是说移植的干细胞并不能替代整个子宫内膜细胞，并且移植后在受损组织内探测到干细胞比例小于0.1%[12]。因此越来越多的学者认为干细胞的旁分泌作用或许是其参与治疗的主要机制，即干细胞主要依靠其外泌体促进组织修复，而不是单纯的细胞替代。

干细胞外泌体是由干细胞分泌的具有脂质双分子结构的微小囊泡，其内包含蛋白质、脂质和核酸，可以在细胞间传递信号及营养物质等。现已将干细胞外泌体用于心肌缺血/再灌注损伤、脑损伤、急性肺损伤和骨再生等疾病的研究中[13]。干细胞外泌体内包含多种趋化因子、细胞因子以及生长因子的转录因子等，在子宫内膜再生方面主要通过促进血管再生、刺激宿主子宫内膜细胞活性以及免疫调节等方式减少细胞死亡，并为宿主细胞提供营养支持和促进宿主组织的再生等。研究证实干细胞分泌的外泌体可以招募血管内皮细胞，并促进其增殖、迁移来促进血管再生，改善宿主血供，促进组织损伤修复[14]；还可以刺激宿主内源性细胞，激活其活性，改善组织微环境，增强内源性修复系统。另外，外泌体的免疫调节作用包括上调抗炎细胞因子，如白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4 等，下调促炎细胞因子，如IL-17和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[15]。由于利用干细胞外泌体相较于干细胞本身更为安全，通过离心、过滤等方式提取干细胞外泌体后，再将含有外泌体的溶液注射至损伤部位的无细胞移植已成为干细胞研究的新热点，有望成为再生医学的新治疗方式[16]。

尽管干细胞相关治疗已获得了大量研究成果，但仍无统一的指导方法可供临床参考。目前研究发现的有关促进子宫内膜修复的干细胞主要有以下几种。

2.1 子宫内膜干细胞 子宫内膜具有强大的自我再生修复潜能，因此预测子宫内膜中可能存在子宫内膜干细胞。1978年，Prianishnikov首次引入子宫内膜干细胞的概念，直到2004年Chan等从人子宫内膜中分离出少量具有克隆特性的上皮和基质类干/祖细胞，并在随后两年证明这些细胞即为子宫内膜干细胞。2009年Gargett等将子宫内膜干细胞作为副细胞群（side population，SP）筛选出来，并发现这些SP具有多种内皮细胞标记，可被诱导成腺上皮、间质细胞和内皮细胞。2011年Cervello等建立了人子宫内膜SP，并将其植入免疫缺陷小鼠的肾包膜下，切除小鼠卵巢予以雌激素补充，结果发现人类子宫内膜干细胞能在小鼠体内存活、增殖，并可转化为子宫内膜细胞。由此推测子宫内膜干/祖细胞的功能缺陷可能是子宫内膜再生障碍的原因[17]。

子宫内膜干细胞的多向分化潜能也引起人们的关注。目前子宫内膜干细胞已经进入IUA、缺血性心肌损伤、肌营养不良及多发性硬化症等疾病的临床研究阶段，在糖尿病、急性肝损伤及其他缺血性疾病也进入动物模型研究阶段[18]。在体内及动物模型的研究中，其安全性及有效性得到了证实，但子宫内膜干细胞获取不易，特别是对于子宫内膜损伤的患者来说，几乎不能实现自体移植，同样也限制了其发展。

2.2 MSC MSC是一类来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身的结缔组织和器官间质中，易获取，在体外具有高度自我更新能力和多向分化潜能，同时具有低免疫原性，可分泌多种抗炎因子，对正常组织损伤较小，现已成为细胞移植和组织工程的新型种子细胞。

2.2.1 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC） BMSC是目前研究较多的一类MSC。2004年Taylor[19]在接受BMSC移植的受体子宫内发现来源于供体BMSC分化的子宫内膜细胞，该发现在大鼠及人体内均得到证实，也就是说子宫内膜中存在的干细胞可能来源于骨髓，提示BMSC可能在子宫内膜重建中具有重要作用。有学者采用尾静脉及原位移植途径将BMSC注射入子宫内膜损伤变薄的雌鼠模型中，随后发现移植组大鼠子宫内膜厚度显著增加，内膜腺体及毛细血管结构较完整，促炎细胞因子如TNF-α、IL-1水平下调，IL-6等抗炎细胞因子水平上调，另外，整合素αγβ3、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、细胞角蛋白及波形蛋白等子宫内膜容受性相关蛋白的表达均明显上调[20-21]。近期一项临床队列研究显示经过自体BMSC移植治疗后，IUA患者的子宫内膜增厚，内膜血管再生，并有患者经过治疗后成功生育，说明BMSC可能促进子宫内膜的损伤修复[22]。

2.2.2 脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cell，ADSC） 研究发现脂肪中可以提取到丰富的高活性的MSC，且ADSC与BMSC存在相似的细胞表型及分化能力，但其来源广泛、取材方便、创伤小、增殖速率快，更具发展前景。对于ADSC的研究已广泛存在，例如骨关节退行性疾病、心肌梗死后心肌细胞再生、肝损伤后肝细胞再生、创面愈合和神经系统损伤修复等方面。在子宫内膜损伤方面，有学者发现移植ADSC能够促进马子宫内膜组织微环境的重构，表明ADSC可能参与子宫内膜损伤修复[23-24]。Kilic等[25]向IUA大鼠模型移植雄鼠来源的ADSC，观察到移植组雌鼠子宫内膜中存在4%～6%雄鼠滞留细胞，并且血管内皮生长因子（VEGF）、增殖细胞核抗原、细胞增殖相关核抗原Ki-67等多种细胞增殖标志物表达升高，子宫内膜纤维化水平下降。此外，该研究还发现，ADSC联合雌激素效果更佳，子宫内膜再生的种子细胞加上激素持续刺激，有效促进了子宫内膜细胞增殖。

尽管ADSC分化能力存在个体差异，且活性随年龄降低，但ADSC的应用优势为：①数量充足，易于获取及扩增，基础实验技术成熟；②对于多数患者特别是子宫内膜损伤的患者来说，ADSC能够实现自体细胞移植。ADSC已获得越来越多的关注，具有巨大的临床应用价值。

2.2.3 脐带间充质干细胞（umbilical cord mesnchymal stem cell，UCMSC） UCMSC体外易分离扩增，具有自我更新和多向分化的潜能，来源广泛，便于取材，对供者无不利影响。目前UCMSC的移植研究主要针对脑损伤、脊髓损伤、帕金森病和心脏损伤[26]。有研究通过尾静脉向大鼠薄型子宫内膜模型注射UCMSC发现，经UCMSC治疗后薄型子宫内膜大鼠子宫内膜厚度无显著改变，但子宫内膜标志蛋白（细胞角蛋白、波形蛋白、整合素β3）的表达均有不同程度的增加，纤维化程度及促炎细胞因子均有下降，由此推断通过UCMSC治疗可以促进子宫内膜损伤后修复[27-28]。近年，戴建武团队使用USMSC与胶原支架结合对25例重度复发性IUA患者进行Ⅰ期临床试验，其中14例宫腔镜评分得到明显改善，8例患者成功妊娠并顺利分娩[29]。UCMSC进一步的临床应用仍需更多的循证医学研究来佐证。

2.2.4 人早孕蜕膜间充质干细胞（human decidual mesenchymal stem cell，hDMSC） hDMSC同样具有自我更新、多向分化能力等特征，且作为医疗废物，其来源广泛，无伦理问题。在生理状态下hDMSC参与修复受损的子宫内膜，并可在体外诱导分化为子宫内膜组织。动物实验显示在子宫内膜受损大鼠尾静脉注射hDMSC后主要分布于子宫腔上皮层，且子宫间质明显增厚，大量腺体增生和小血管新生，纤维化程度减弱，子宫内膜标志蛋白（细胞角蛋白、波形蛋白）和子宫内膜容受性标志物整合素αβγ3表达量升高，而代表纤维化程度的转化生长因子β1（TGF-β1）表达量降低，证明hDMSC可在受损的大鼠子宫内膜中存活、增殖，并促进大鼠受损的子宫内膜修复，抑制IUA的发生[30]。

2.2.5 人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cell，hAMSC） 人羊膜是胎儿与母体间的隔膜，是胎盘的最内层，具有无血管、无神经、无淋巴等特点。羊膜基底层和基质层含有大量不同的胶原，主要是Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原蛋白、纤维黏连蛋白和层黏连蛋白，这些成分使得羊膜可以充当细胞移植支架。羊膜主要由人羊膜上皮细胞和hAMSC组成，其中hAMSC具有多向分化潜能，在体外可向脂肪、成骨、内皮、肝细胞、神经细胞诱导分化，且具有来源丰富、取材方便、不涉及伦理问题、低免疫原性、无致瘤性等优点。可再生医学中hAMSC可成为新移植细胞来源。研究发现宫腔局部注射hAMSC后，可以促进IUA大鼠子宫内膜修复，降低促炎细胞因子TNF-α及IL-1表达，增加抗炎细胞因子IL-6及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表达[31]。现阶段羊膜在妇产科的应用主要是其隔膜作用，随着研究的进展，希望hAMSC将会有更多应用。

2.2.6 月经血间充质干细胞（menstrual blood-derived stem cells，MenSCs） MenSCs来自女性月经排泄，正常女性子宫内膜自然脱落即形成月经，分离获取MenSCs的过程对人体是非侵入性的，易于收集，并且不涉及伦理道德问题。因此，人们对MenSCs的功能及其在再生医学中的潜在应用越来越感兴趣。目前MenSCs在子宫内膜损伤方面也有不少研究。对IUA小鼠通过尾静脉注射人MenSCs后发现子宫内膜厚度及微血管密度均增加，还可以改善小鼠的生育能力。在MenSCs治疗IUA的临床试验中，7例经治疗的重度IUA患者中，有5例子宫内膜厚度明显增加至7 mm，并有3例成功妊娠[32]。虽然目前研究结果仍存在一些问题和局限性，如经血保存及采集污染率等，但MenSCs的治疗潜能仍值得深入探索[33]。

3 结语

目前对于子宫内膜损伤后修复仍然是一个巨大的医学挑战。预防子宫内膜损伤的发生仍应放在首位，而唯一确定有效的治疗方法是宫腔镜手术，既能很好的评估损伤程度，也能在一定程度分离粘连，为内膜修复创造机会。干细胞的治疗，特别是MSC，由于其来源广泛、易于获取、免疫原性低，还可分泌多种抗炎细胞因子，对正常组织损伤较小，具有更多的应用前景。但干细胞疗法仍需大量可靠的实验数据及切实可行的临床方法铺路，希望随着研究的进一步深入，这些新方法将为子宫内膜损伤后修复带来新的希望。