肝脏类器官构建方式的研究进展

薛瑞丰，王经琳，施晓雷，

（1.南京医科大学附属鼓楼临床医学院 普外科，江苏 南京 210005；2.南京大学附属鼓楼医院 普外科，江苏 南京 210008）

肝移植是终末期肝病治疗的唯一有效方法，但存在供肝来源相对短缺、术后需要终生服药等问题[1]，因此急需探索新的替代性治疗方式。细胞移植和组织工程肝脏是替代性治疗的两个主要方向。现有研究表明成体肝细胞体外培养增殖能力低、规模化培养困难，无法满足临床治疗的需要[2]。目前细胞移植疗法多使用干细胞，相比于成熟肝细胞，干细胞来源广泛、增殖能力强[3]，但同样也存在一些问题如人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）涉及伦理，人诱导多功能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）的增殖受到表观遗传异常影响[4]，此外细胞的植入效率低、易转移都是疗效的不稳定因素。组织工程肝是基于生物材料、细胞生物和工程技术的原理，用肝细胞或肝样细胞结合支架材料，体外构建一个完整的、具有功能的肝脏组织器官，用以对病变肝脏进行形态、结构和功能的重建进而永久性替代的技术[5-6]。类器官是组织工程肝的一个主要研究方向。类器官是指以一定的顺序和三维的方式在体外的联合培养的具有细胞-细胞/细胞-基质相互作用的组织特异性细胞的集合。根据靶组织的不同，类器官可以是球形也可以是不规则团块状，直径从0.1 mm到1 mm不等。他们在基因表达、组织结构与体内靶器官有明显的同源性，且功能相似，经历类似的细胞形成、生长和成熟过程，通过原位/异位移植能发挥治疗作用[7]。本文就近年来几种主要肝脏类器官构建方式的研究进展作一综述。

1 类器官的构建方法

1.1 细胞片

细胞片是指在底部共价固定的聚N-异丙基丙烯酰胺（poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm）材料的温度培养皿中，当温度高于临界溶解温度（lower critical solution temperature，LCST）32 ℃时，培养基表面略疏水，便于细胞黏附、扩散、增殖；当调控温度低于32 ℃时，培养基表面和黏附的细胞之间形成水合层，细胞脱落可获得完整薄片状的细胞[8]。细胞片技术的关键是保证细胞-细胞连接和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白完整[9-10]。传统的细胞移植方式如脾脏移植，易失去细胞与细胞外基质的连接作用支持，70%以上的肝细胞被巨噬细胞清除[11-13]。将人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞（induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells，iPS-hlcs）以细胞片的形式移植到损伤肝脏的表面，细胞的定植率明显提高，iPS-hlcs细胞片中形成血管结构，为细胞提供营养和氧气，独特的多层结构解决了细胞大量移植可能引发的栓塞的问题[14]。除了原位移植之外，肝细胞和成纤维细胞共培构建的细胞片（engineered hepatocyte fibroblast sheets，EHFSs）移植到皮下，能分泌血管内皮生长因子、转化生长因子β1和肝细胞生长因子促进供肝的血管化，进而提高移植的成功率[15]。细胞片能替代受损组织，改善器官代谢和内分泌功能，并通过将各种蛋白递送到受损组织减弱病理微环境对机体的影响。现阶段临床上使用的细胞片多来自于自体细胞，移植术后的免疫排斥反应风险较低[16]。然而自体细胞的体外培养所需成本大、周期长，限制了其发展的空间，同种异体细胞可能是未来细胞片技术发展的方向，但需要注意异种病毒的传播和免疫排斥的风险。

1.2 脱细胞支架

器官或组织在去除细胞后剩余的结构和功能蛋白质的复合体即为脱细胞支架[17]。传统支架主要有聚乳酸（polylactic acid，PLA）、乳酸-乙醇酸共聚物（Epoly 1actide-co-glycolide，PLGA）等生物聚合物材料支架和胶原、海藻酸钠等天然材料支架[18]。最新研究发现用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（sodium laurylsulfonate，SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（triton X-100）或其他洗涤剂及酶解物经肝门静脉进行循环灌注，细胞全部排出后，得到的脱细胞支架有如下三个优点：有适合细胞生长发育的三维多孔结构，细胞外基质成分比例不变和主要血管结构、胆管通道保持完整[19]。将小鼠再细胞化的支架移植进大鼠的肝脏，发现新形成的肝脏能维持与体外正常肝脏相当的特异性功能，包括白蛋白（albumin，ALB）分泌、细胞色素P45表达和尿素合成。这些结果初步论证了再细胞化的脱细胞支架移植治疗的可行性[20]，但支架的再细胞化过程仍可以进一步优化，如加入肝窦内皮细胞的和微血管内皮细胞，能促进移植物血管化并防止由胶原基底膜直接暴露于血液中引起血栓[21]。将猪肝脏脱细胞支架血管内壁用血管内皮细胞抗体覆盖，促进血管内皮化，随后再细胞化体内移植，血栓形成明显减少。此外，脱细胞支架细胞的定植和功能发挥需要生长因子的协助，如胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等[21]。同时输注细胞密度和数量会影响细胞的定植和功能发挥[22]。鉴于构成肝脏的几种细胞功能和分布具有高度的综合性和特异性，关于重建细胞与细胞间相互作用的研究尚无相关的报道，可能是未来支架技术的发展的一个方向。

1.3 嵌合肝

嵌合肝是指同时具有免疫缺陷和肝细胞损伤死亡特性的动物模型，经其他来源肝细胞或干细胞移植后，供体细胞逐步增殖并取代宿主肝脏，形成含有不同种属肝细胞的混合肝[23]。2004年Tateno C等[22]将人源性肝细胞脾内移植到尿激酶型纤溶酶原激活物/重症联合免疫缺陷（urokinase-type plasminogen activator/severe combined immune-deficiency，uPA/SCID）小鼠中，供肝细胞增殖并取代宿主肝脏，构建的嵌合肝模型能用于肝细胞功能和药理学反应的初步评估[24]，但也存在一些问题如移植后供体细胞再增殖率低（15%）、小鼠病死率高等。Bissig KD等将肝细胞经肝内注射移植进受体富马酸乙酰乙酸水解酶敲除（fumarylacetoacetate hydrolase-deficient，fah-/-）小鼠，与uPA/SCID模型相比，构建方法更简便，且供体细胞增殖模式与既往脾内移植方式相似，细胞的再增殖率最高可达50%，且小鼠的存活率也有显著提高。最近Ren XN等[25]用Alb-cre转基因小鼠及白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor，DTR）转基因小鼠与SCID小鼠杂交，得到转基因免疫缺陷小鼠。腹膜注射白喉毒素诱导肝损后，人源肝细胞移植成功构建了嵌合肝模型。血清丙氨酸转移酶（alanine transaminase，ALT）、ALB分别于术后第7、28天恢复至正常水平，第30天在小鼠肝脏中发现人源性Kupffer细胞。该研究成功构建了一种具有可植入人肝细胞的新模型，小鼠肝脏可以携带人源性库普弗细胞，且能维持肝细胞的增殖及功能发挥，为肝脏再生研究和疾病发展提供了基础生物学研究平台。

1.4 肝芽

小鼠胚胎发育的第9天，邻近心脏中胚层和横隔膜的前肠腹侧区域增厚以形成肝憩室，随后憩室从单层的立方形内胚层细胞转变为多层假复层细胞（成体肝细胞）。成体肝细胞经分层，增殖并转移到周围的隔膜横突以形成肝芽[26]。Takebe等[27]将人类诱导多能干细胞分化的肝脏内胚层细胞（induced pluripotent stem cell- endoderm cell，iPSC-HEs）、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和MSC体外共培构建肝芽，移植到小鼠肠系膜，移植物能快速血管化并表现部分人类肝脏特有的功能如产生ALB。Takebe等[28]首次成功构建了体外血管化器官，证明了肝芽培养用于肝衰竭治疗的潜力。鉴于肝芽培养重复性，扩增规模的问题，该团队结合工业化技术，设计一种三维培养平台阵列板，成功实现了体外肝芽得稳定、大规模的扩增培养，但因为细胞培养使用的基质胶变异性较大，限制了肝芽得进一步应用。Ng SS等[29]设计了一种倒置胶体晶体（inverted colloid crystal，ICC）聚合支架，用于肝芽的培养。因为该支架自上而下的制造方法，通过支架得孔径，能定制细胞发育不同阶段所需的基质，完美的模拟肝芽生长的细胞外生态位。ICC工程化产生的类器官在形态学、基因表达、蛋白质分泌、药物代谢和病毒感染方面更接近成体组织，并且在植入免疫缺陷小鼠的肝脏后可以整合入受体肝脏。

2 总结

肝脏是一个具有复杂的结构和功能的器官，原代肝细胞由于体外增殖能力低，培养成本高而无法满足临床治疗的需求。通过干细胞或者以其为基础的多种细胞共培，辅以生物材料技术手段，重现或取代肝细胞功能一直是类器官构建研究的方向，而细胞片、脱细胞支架、嵌合体和肝芽为制备人源化肝脏提供了有效途径。细胞片技术强调细胞表面蛋白，细胞与外基质之间作用蛋白的完整；脱细胞支架的应用强调的是给细胞提供一个合适的生长环境，辅之以促细胞生长因子。嵌合体要求受体对供体细胞较弱的免疫排斥，提供一个促进供体细胞增殖的微环境。肝芽是多种细胞共培，通过细胞间的相互作用，模拟体内环境，自组装成肝芽。从上述的构建方式中，我们可以发现体外器官的重建，细胞间的相互作用，细胞外部的生长环境两者缺一不可。目前，上述方法均已取得了一定的成果，但离应用于临床肝移植仍有较大的差距，有待进一步改进。我们相信，多种学科联合的类器官技术将是解决供肝短缺的问题的有效手段，能为终末期肝病治疗带来新的希望。