水凝胶在骨科中的应用

张瑜博 韩培

水凝胶为具有亲水性聚合物链的3D网络结构，且含水量为90%～99%，有助于有效的氧气与物质交换[1]。在过去几十年中，水凝胶因具有生物相容性高、免疫原性低和理化性质可调节等特征而在生物医学领域中得到了前所未有的发展[2]。水凝胶的多聚体系统可为细胞的移植和分化、内源性再生、生物修复、伤口愈合及药物持续传递提供良好的基质[3]，而其三维网络系统则可模拟原始细胞外基质的微结构，为细胞存活提供活体生态条件[4]。

1 在骨组织工程中的应用

骨缺损为骨科临床常见病，目前多采取自体或异体骨移植的方法治疗[5]。移植治疗可造成供区部位损伤且供体难以获得，故其应用受到限制[6]。为解决上述问题，以水凝胶为支架材料的骨组织工程应运而生。

水凝胶是一类独特的支架材料，具有由交联的高分子链组成的三维亲水网络结构，在吸收相当于自身体积几倍数量的水后仍可保持不分解。因此，水凝胶可以模拟自然的组织环境，为缺损部位提供结构支持，使骨缺损通过内在愈合机制修复[7]。

据报道，可注射原位成型水凝胶已广泛用于骨科临床[8]。与需要外科植入的预制支架不同，水凝胶可以注射到缺损处，原位成胶有助于对抗任何几何变形，且侵入性较低[9]。Yoon等[10]制备了基于可见光固化乙二醇壳聚糖的可注射水凝胶系统，该水凝胶在结合骨形态发生蛋白(BMP)-2和(或)转化生长因子(TGF)-β1后，可在30 d内持续释放生长因子；体内外研究均显示，该水凝胶可促进碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素等相关mRNA的表达，并可增加胫骨缺损部位的骨量和骨矿物质密度，提示其在骨缺损治疗方面具有应用价值。此外，温度响应性水凝胶在体内的应用也有独特的优势。Liao等[11]将双相磷酸钙陶瓷微粒作为矿化骨基质嵌入含有透明质酸-g-壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)(HA-CPN)的温度敏感性水凝胶基质中，并用富含血小板的血浆对其进行强化，该复合物可捕获兔脂肪来源的干细胞，并具骨诱导能力，可提升细胞增殖速率和碱性磷酸酶活性，促进钙沉积和细胞外基质矿化，并上调成骨标志基因表达，将该构建体植入兔颅骨缺损处后缺损部位有新骨形成，证实该温度敏感性复合水凝胶可促进兔脂肪来源干细胞的骨生成，有望应用于骨组织工程。

感染可影响骨折愈合过程，而由水凝胶聚合物和矿化组分合成的抗菌骨移植物具有易于获得、成本低及理化性质可调节等特征，成为骨替代物的优选。Xu等[12]用贻贝激发的聚多巴胺(PDA)在聚乙烯(PE)水凝胶上原位合成银纳米粒子(AgNP)并对其予以矿化，发现AgNP/PDA水凝胶具有抗菌和促进移植物矿化的双重功能，可促进骨骼生成，并具有上调骨涎蛋白、碱性磷酸酶、骨钙蛋白及Runt相关转录因子2等成骨标志物表达的能力；体内实验也证实，该水凝胶可有效修复上颌骨缺损，并可显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，在修复伴有感染的骨缺损情况中可加快愈合进程。

Zhu等[13]合成了可负载血管内皮生长因子的温度敏感性纳米因子，经聚合酶链式反应(PCR)实验证实，该粒子可促进Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子和骨钙素等成骨标志物的表达，也可促进血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、血管性血友病因子(vWF)和激酶插入域受体(KDR)等血管生成标志物的表达。上述结果提示，用该粒子制备的水凝胶复合物可通过上述方式促进人骨髓间充质干细胞(BMSC)的成骨分化和血管生成，有助于提高工程化骨组织的质量。

水凝胶材料在骨组织工程应用中具有独特的优势，而多种制备技术及材料的开发则为实现不同的骨缺损修复目标提供了更多的选择。

2 在软骨组织工程中的应用

年龄增加、外伤和关节退行性改变均可成为软骨损伤的危险因素。软骨由于缺乏血管、神经、淋巴网络和原始细胞等，很难实现自我修复，一旦损伤，通常需要通过外科手段进行替换[14]。软骨组织工程目的在于制备有功能且无瘢痕的组织。水凝胶作为适用于组织工程的支架材料之一，已被广泛研究[15]。

鉴于软骨强度的特殊性，软骨组织工程所需的水凝胶材料不但要具有生物相容性，而且要兼具一定的机械性能。开发具备上述特征的水凝胶材料已成为研究热点。Han等[16]设计了聚多巴胺/硫酸软骨素/聚丙烯酰胺水凝胶，并证实其具有良好的组织黏附性和坚韧的机械性能。与传统的硫酸软骨素水凝胶相比，该水凝胶能够促进软骨的形成和分化，可为软骨细胞生长和软骨再生创造无生长因子的仿生微环境，并可满足软骨修复的机械要求。Deng等[17]通过双物理交联策略开发了新型κ-角叉菜胶/聚丙烯酰胺双网络水凝胶，该水凝胶显示出优异的断裂拉伸应力[(1 320±46) kPa]和韧性[断裂能：(6 900±280) kJ/m3]，并具有优异的干细胞相容性，适用于软骨组织工程。

可注射水凝胶可用于微创修复手段，因而更具可操作性。Qi等[18]将丝胶蛋白转化为功能性丝胶蛋白甲基丙烯酰，后者包载软骨细胞后，可在UV光照射下通过光交联形成原位水凝胶，在向体内注入该水凝胶8周后，有效的人造软骨即可形成，其细胞外基质组分积累量增加，且软骨关键基因表达上调，在分子水平上类似于天然软骨。除软骨细胞，人BMSC也可作为软骨组织工程重要的种子细胞。Li等[19]设计了一种通过N-羟基琥珀酰亚胺-胺偶联发生组装的构建体，该构建体能够包载人BMSC并保留其活力和功能，在被植入体内后可促进软骨形成标志物表达上调和Ⅱ型胶原含量增加，有利于形成成熟的透明软骨结构。除细胞外，生长因子也可被包裹进入水凝胶，从而实现局部释放。Jooybar等[20]将血小板裂解物掺入载有细胞的可注射透明质酸/酪胺水凝胶中,其中血小板可作为自体且廉价的生长因子来源，而该水凝胶可在包载人BMSC后被注入体内，结果显示Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖逐渐沉积，细胞外基质沉积与凝胶降解同时进行，坚韧的致密基质最终形成，提示可注射的刺激响应性水凝胶具有作为软骨再生支架的巨大潜力。

由于软骨-骨结构的特殊性，形成具有自主有序发育的软骨-骨的多层结构仍是一项复杂挑战。Stüdle等[21]设计了一种双层水凝胶，一层为以TGF-β3或BMP-2功能化并通过酶促聚合包载人BMSC的聚乙二醇水凝胶层，另一层为含有人鼻软骨细胞(NC)的水凝胶层，将2层水凝胶组合并异位植入裸鼠，发现人BMSC负载层可重复进行软骨内骨化并产生类骨组织，而NC负载层则可形成表型稳定的软骨组织。Kang等[22]为获得更好的骨-软骨组织，设计了一种3层支架，以用于支持骨形成的富含磷酸钙的水凝胶作为矿化底层，以具有各向异性多孔结构的冷冻水凝胶作为中间层，以用于支持软骨组织形成的水凝胶作为顶层，底层保持无细胞，顶部2层则在植入前包载细胞，体内植入的包载细胞的3层支架在骨表面形成了富含润滑素的软骨结构。上述结果提示，将包载外源性细胞的软骨组织工程与支架驱动的原位骨组织工程相结合，是构建骨-软骨组织类似物的有效途径。

新型3D打印技术在软骨组织工程中的应用也是目前研究的热点。Xia等[23]用明胶和透明质酸制备水凝胶，并用3D打印技术精确控制外部3D形状和内部孔结构，将甲基丙烯酸酐和光引发剂引入水凝胶系统中可使上述材料在3D打印期间发生光固化，进一步对上述材料予以冻干则可增强其机械性能并延长其降解时间；山羊体内外实验均证实，该支架结合软骨细胞可使具有典型空隙结构和软骨特异性细胞外基质的成熟软骨成功再生。这种新颖的3D支架具有令人满意的外形、孔结构、机械强度和降解速率，且其软骨再生的免疫原性较弱。

除干细胞移植外，基于干细胞归巢的水凝胶技术也是一种有前景的软骨修复方法，可以解决技术复杂性和安全性等问题。Lu等[24]将无细胞软骨基质与功能化的自组装肽组合，使其具有骨髓归巢的功能，构建复合水凝胶支架，将该支架植入兔膝关节的全层软骨缺损处，7 d后体内基于CD29+/CD90+双阳性细胞的间充质干细胞(MSC)募集增加，且聚集蛋白聚糖、Sox9和Ⅱ型胶原等软骨相关标志物的表达上调，3、6个月后软骨样组织完全覆盖关节软骨缺损，表面光滑，与周围原生软骨相似。Sun等[25]用去细胞软骨基质衍生的支架与功能化自组装肽纳米纤维水凝胶修复兔软骨缺损，1周后复合支架组不但实现缺陷部位内源性MSC的募集及浸润细胞向软骨细胞谱系的分化，而且实现透明样软骨的良好修复和软骨下骨的成功重建，而对照组多为纤维组织修复。上述研究为无细胞移植的体内软骨修复提供了一种有前景的方法。

Aisenbrey等[26]将人MSC封装在含有硫酸软骨素的光敏感性聚乙二醇水凝胶中，在动态压缩载荷或自由肿胀条件下培养3周，并用定量PCR和免疫组化方法对其进行鉴定，结果显示动态负载的硫酸软骨素可通过抑制Smad1/5/8和上调p38分裂原激活蛋白激酶(MAPK)产生支持MSC软骨形成和减轻纤维化的物理、化学信号。

3 在皮肤创面愈合中的应用

皮肤作为覆盖于人体表面的器官，很容易受到各种外界损伤[27]。大面积皮肤缺损由于供区皮肤难以获得、恢复期较长及手术本身会带来损伤，修复较为困难[28]。作为新型的伤口和创面敷料，水凝胶具有较高的保水能力和很好的生物相容性，可促进细胞迁移和再上皮化，已获得广泛关注[29]。

多数伤口敷料既不能实现皮肤的无瘢痕再生，也不能实现毛囊和皮脂腺等附属物的完全恢复。Qi等[30]开发可光交联的丝胶蛋白水凝胶(SMH)并将SMH作为新型伤口敷料植入小鼠全层皮肤缺损模型以修复缺损，结果显示其不仅可以实现皮肤的无瘢痕愈合，而且有利于毛囊和皮脂腺等皮肤附属物的功能性再生。此外，为解决关节处的皮肤创面愈合，设计具有合适机械性能的伤口敷料有重要的实际意义。Qu等[31]设计了一种可自我修复的多功能可注射胶束/水凝胶复合材料，发现其具有与人体皮肤相当的模量及良好的伸缩性、压缩性和黏合性，且自愈能力、止血性能和生物相容性均良好，为关节处皮肤创面的愈合提供了良好的选择。具有良好机械性能并可自我修复的水凝胶作为皮肤创面愈合的敷料材料应用前景广阔。

除可以作为伤口敷料外，水凝胶材料还具有促进止血、加速组织再生并刺激成纤维细胞合成胶原的特性，在皮肤组织工程中广泛用作皮肤替代材料[29]。Lei等[32]设计了一种新型生物相容性温度敏感性水凝胶，可携带BMSC；体内植入实验证实，该复合体可明显促进创面愈合，不但可加速上皮细胞增殖和再上皮化，减少伤口和伤口周围组织的炎症反应，而且能够促进胶原沉积、TGF-β1和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌和组织重塑，为皮肤组织工程提供了一种有前景的应用策略。此外，慢性难愈合糖尿病创面治疗和完全皮肤再生是临床上巨大的挑战，从多功能水凝胶中控制释放生物活性因子是修复慢性创面有前途的策略[33]。Wang等[34]开发了一种可注射的F127/氧化透明质酸/聚ε-L-赖氨酸(FHE)水凝胶，该水凝胶具有自我修复能力并含有抗菌多肽，在结合脂肪来源的间充质干细胞外泌体(AMSCs-exo)后，具有可注射的优点，可在pH刺激下释放外泌体，并具有有效的抗菌活性，能够加速皮肤愈合过程；体内实验证实，与单独外泌体或FHE水凝胶相比，结合了外泌体的FHE水凝胶显示出更好的愈合效果，可显著增强糖尿病患者全层皮肤创面的愈合效率，增加创面闭合率并促进血管的快速生成、再上皮化和胶原沉积，且在经结合了外泌体的FHE水凝胶处理的创面中也可出现皮肤附属物和较少的瘢痕组织，表明其具有实现皮肤完全再生的能力。该研究为制备可控制外泌体释放的多功能水凝胶提供了新途径。

Xi Loh等[35]设计了一种纳米纤维素/丙烯酸水凝胶，在分子水平上研究水凝胶影响人真皮成纤维细胞(HDFS)的行为，结果发现该水凝胶可影响白细胞介素(IL)-6、IL-10、基质金属蛋白酶(MMP)-2、组织蛋白酶K(CTSK)、成纤维细胞生长因子(FGF)-7、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TGF-β1、环氧酶(COX)-2和凝血因子Ⅲ(F3)等9个伤口愈合因子的表达，具有维持HDFS活性和形态、限制细胞迁移、促进细胞快速转移和加速伤口愈合的能力。

水凝胶的理化性质和生物性质独特，可作为有效的皮肤再生材料之一。此外，在水凝胶中加入功能性生物分子或生物材料的设计也是一种很有前途的方法。

4 水凝胶应用现状及展望

随着材料科学的发展，大量多功能材料应运而生，并应用于生物医学领域的各个方面。在近年各种生物材料的研究中，水凝胶由于具有成本低、功能多、可再生、可降解及生物相容性良好等优点而备受瞩目。水凝胶在骨科领域中的应用主要聚焦于组织工程、创面愈合以及药物传递等研究，部分研究结果已应用于临床。随着生物材料和生物反应器的发展以及学者们对组织修复的细胞信号机制的了解进一步深入，水凝胶将可以更精确地模拟天然细胞外基质，在骨及软组织修复中发挥更大的作用。