益母康颗粒对小鼠的急性毒性研究

张学全，阚琦缤，褚秀玲，苏建青

(聊城大学农学院，山东聊城 252000)

益母康颗粒是在经典方剂生化汤[1]的基础上，配伍益母草等多味中药研制而成的。益母草为唇形科植物，一年生或两年生，是新鲜或干燥的地上全草，始载于《神农本草经》，列为上品，是常用的中药材[2]。益母草味辛、微苦、性微寒，归心、肝、膀胱经，具有活血调经、利水消肿、清热解毒等功效[3]。现代医学研究表明，益母草具有溶栓、抗凝、降脂、降低红细胞聚集、降血黏度、抑制血小板聚集、改善微循环、抗氧自由基和减少细胞内钙超载等作用[4-5]。益母草在临床上被用于治疗月经不调、产后瘀痛、心血管疾病、血液病等[6]。笔者所在实验室在传统汤剂生化汤的基础上，加入益母草等中药，并制备成方便使用的颗粒剂型。为了评价益母康颗粒剂的安全性，根据中国兽药典的规定和最新发布的急性经口毒性试验方法的相关记载[7-8]，笔者进行了益母康颗粒灌胃给药的小鼠急性毒性试验。

1 材料与方法

1.1试验动物及其饲养条件昆明种SPF小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，购自山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号为SCXK(鲁)20140007，动物质量合格证号为37009200004391。饲养小鼠的动物房室温通常在22 ℃左右，相对湿度在50%左右，采用自然光照，小鼠使用专用料喂养。试验前，所有小鼠先隔离饲养3 d，观察小鼠的健康状况及精神状态，选择健康小鼠进行分组试验。

1.2试验器材与试剂电子天平(型号LE204E/02，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)、自动蒸汽灭菌锅(型号GI54TR，致微(厦门)仪器有限公司)、KD-BM生物组织包埋机、KD型冷冻石蜡切片机、KD-T型电脑生物组织摊烤片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、离心机、鼠笼(带有水壶)、小鼠饲料、垫料、100 mL容量瓶若干、一次性注射器、灌喂器、酒精棉球、镊子、剪刀等实验室常用解剖用品；甲醛、乙醇、二甲苯、苏木素、伊红、石蜡、盐酸等均为化学纯试剂。

1.3分组与给药将60只小鼠随机分为10组，其中雄性5组，雌性5组，根据急性毒性指导原则[9]，雌性、雄性各设置益母康颗粒水溶液5 000、1 667、557和186 mg/kg 4个给药组及1个空白对照组，空白对照组用等量蒸馏水代替，并对小鼠做好标记，加以区分。试验前小鼠禁食12 h，不限制饮水。试验开始时小鼠称重并记录，根据小鼠体重灌胃给药，连续给药观察7 d，在第4天和第7天分别对小鼠称重，并做好记录。

1.4临床症状观察每天观察试验小鼠的精神、采食、饮水、呼吸、被毛、粪便和运动等状况以及是否有死亡情况，试验结束后称量饲料，计算小鼠采食量。

1.5剖解观察及脏器指数计算使用乙醚麻醉，处死并解剖小鼠，观察小鼠各脏器有无肉眼可见病理变化，采集小鼠的心、肝、脾、肺、肾，用纸吸干血迹，精确称量各脏器的重量，计算脏器指数。按照如下公式计算脏器指数：脏器指数=脏器重(湿重)/体重×100%。

1.6组织病理学检查取高剂量组(Ⅰ)和空白对照组(CK1)雌性小鼠的新鲜脏器(心、肝、脾、肺、肾)各2块，修剪后置于10%甲醛溶液中浸泡24 h，放入组织包埋盒中用流水冲洗12 h除去固定液，先后用75%、85%、95%、100%乙醇脱水1 h；置于二甲苯中浸泡透明10 min，将包埋盒置于65 ℃蜡中浸蜡1 h，然后将组织块包埋，用切片机切片，然后展片，烤片，再进行2次二甲苯脱蜡10 min，先后用100%、95%、85%、75%的乙醇脱二甲苯，自来水洗5 min，苏木素浸泡3 min，再水洗5 min，1%盐酸酒精分色30 s，再水洗5 min，75%、85%乙醇各3 min，伊红浸泡3 min，最后封片使用显微镜观察并保存图片。

1.7数据处理采用Microsoft Excel软件进行汇总与计算分析，数据均以“平均数±标准差”表示，使用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行统计与分析，采用单因素方差分析进行组间数据比较。

2 结果与分析

2.1临床症状观察临床观察结果显示，小鼠在给药后，除了个别小鼠活动减少，出现怠动、呼吸加速现象外，其他小鼠均表现正常，表现异常的小鼠1 h后自发活动逐渐增加，2 h后逐渐恢复正常状态，可能是由于灌胃对小鼠造成的不适所致。在整个饲养过程中，小鼠毛色光滑，粪便、尿液、摄食、活动均表现正常。小鼠采食量和体重明显增长，且7 d内无其他异常状况发生。给药1～7 d,试验小鼠均没有出现死亡，全部存活，受试动物的LD50大于5 000 mg/kg，说明益母康颗粒较为安全。

2.2体重变化雌、雄小鼠体重分开统计。由表1可知，给药前4个给药组和空白对照组雌、雄小鼠体重无显著差异(P>0.05)。给药过程中，各给药组和空白对照组雌、雄小鼠体重在给药后至试验结束均呈增长趋势，而各给药组与空白对照组小鼠体重及其增重均无明显差异(P>0.05)，各给药组与空白对照组小鼠的增重及采食量无明显差异(P>0.05)，说明益母康颗粒对雌、雄小鼠的体重均无显著影响。

表1 益母康颗粒对小鼠的增重及采食量的影响

2.3解剖和脏器指数变化解剖结果显示，小鼠的脏器形态和色泽均正常，没有发现炎症现象。这说明益母康颗粒没有引起小鼠内脏肉眼可见的病理变化。由表2可知，各给药组雌、雄小鼠的脏器重量与对应对照组相比差异均不显著(P>0.05)。4个给药组雌、雄小鼠的心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数和肾脏指数与相应对照组相比差异均不显著(P>0.05)。

表2 益母康颗粒对小鼠脏器指数的影响

2.4病理组织学变化观察从图1可以看出，雌性小鼠高剂量(Ⅰ)组肝脏的细胞形态完整，肝索清楚，结构正常；雌性小鼠高剂量组(Ⅰ)肾脏的肾小球结构清晰，形态良好；雌性小鼠高剂量组(Ⅰ)脾脏的脾髓结构清楚，淋巴小结完整；雌性小鼠高剂量组(Ⅰ)肺脏的肺泡结构完整，细胞清晰；雌性小鼠高剂量组(Ⅰ)心脏的心肌细胞形态正常，结构完整。由此可见，益母康颗粒对小鼠的脏器没有造成病理组织学损害。

3 讨论

生化汤是胎产类疾病的主要方剂。益母草是比较常见的具有活血、化淤功效的中草药，其生物学活性较高，能被广泛应用于临床上，可用于治疗多种疾病。兼具二者优势的益母康颗粒应用前景非常广阔。随着相关研究的深入，需要对新兽药益母康颗粒进行安全性评价。

注：a.CK1组雌性小鼠心脏；b.Ⅰ 组雌性小鼠心脏；c.CK1组雌性小鼠肝脏；d.Ⅰ 组雌性小鼠肝脏；e.CK1组雌性小鼠脾脏；f.Ⅰ 组雌性小鼠脾脏；g.CK1组雌性小鼠肺脏；h.Ⅰ 组雌性小鼠肺脏；i.CK1组雌性小鼠肾脏；j.Ⅰ 组雌性小鼠肾脏Note：a. Heart of female mice in CK1 group; b. Heart of female mice in I group; c. Liver of female mice in CK1 group; d. Liver of female mice in I group; e. Spleen of female mice in CK1 group; f. Spleen of female mice in I group; g. Lung of female mice in CK1 group; h. Lung of female mice in I group; i. Kidney of female mice in CK1 group; j. Kidney of female mice in I group图1 益母康颗粒对小鼠组织学病理变化的影响(HE染色，100×)Fig.1 Effects of Yimukang granule on the histopathological changes in mice (HE staining，100×)

安全性评价的第一步是急性毒性试验，其原理是动物一次或24 h内多次接触外源受试物后，观察急性毒性反应及其程度以及中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性反应的剂量、反应关系，求出LD50。通过该试验可了解受试物对机体的毒性效应，为今后的相关研究提供参考。许多中药制剂的毒性很小，常常无法测出其LD50，故而通过最大耐受量或最大给药量来测定试验动物对这些中药制剂的耐受量[10-12]。该试验根据性别设置4个给药组和1个空白对照组，结果发现益母康颗粒对小鼠的状态无明显影响，且对小鼠体重、采食量、脏器重量、脏器指数及病理组织学无不良影响，由此可见益母康颗粒对小鼠的毒性作用很低。该研究可为益母康颗粒的进一步开发利用提供参考。