噻虫嗪对胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的拮抗作用

任 月，蔡滨海，张爱民

(1.河北叶虹时光农业发展有限公司，河北石家庄 050000；2.河北大学生物技术中心，河北保定 071000)

微生物菌剂是指含有一种或多种有效菌经过工业化生产扩繁后加工制成的活菌制剂[1]，从广义上讲，是指含有不定种类的有益菌，具有一定的肥料效应的生物制剂，具有环保、生态及应用范围广泛等特点。研究表明微生物菌剂在改良土壤、提升地力、提高肥料利用率、降解污染物、净化和修复土壤、预防植株病虫害、提高农作物产量和品质以及保护环境等方面表现出不可替代的作用[2]。其中胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等菌株在农业微生物肥料领域应用较为广泛。胶冻样类芽孢杆菌(P.mucilaginous)是一种可以分解土壤中磷、钾矿物质的一类细菌，具有分解土壤中硅酸盐、铝酸盐及云母等矿物质，释放其中的磷、钾等多种微量元素供作物吸收利用，从而达到提高作物产量的目的。该菌株作为我国生物肥料生产中的一类重要功能菌，在转化利用土壤中矿物质元素等资源在国内很多微生物肥料生产企业中得到了广泛应用，它对生态农业发展、经济农业发展具有重要的意义[3]。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)可以产生多种抗菌物质，有效地抑制植物病原菌的侵染[4]。地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)可以抑制其他有害生物的繁殖及对作物的入侵，提高植株抗性，具有一定的增产作用[5]。

噻虫嗪是一种常见的杀虫剂，它属于第 2 代烟碱类高效低毒杀虫剂，广泛应用在蔬菜类、瓜果类、烟草、中药材、苗木花卉等多种作物。它可有效防治各种蚜虫、叶蝉、飞虱类、粉虱、金龟子幼虫、马铃薯甲虫、线虫、地面甲虫、潜叶蛾等害虫及对多种类型化学农药产生抗性的害虫[6-7]。该药剂的内吸、传导性很强，施药后迅速被内吸并传导到植株各部位[8]。在兰花种植过程中，花农往往会施用微生物菌肥，以达到苗木健壮、促进生根开花和服盆等目的，而当兰花受到介壳虫、叶螨、蚜虫等害虫的危害时，花农会选用高效低毒的噻虫嗪作为喷雾或灌根的杀虫剂，但目前尚未见此药剂与微生物菌剂兼容性之间关系的研究报道。

为研究杀虫剂噻虫嗪对微生物菌剂功能菌株的影响，确定其最适使用浓度，研究97%噻虫嗪原药对微生物菌剂主要功能菌株的拮抗作用，旨在为评价噻虫嗪的合理使用及与微生物菌剂混合使用提供一定的理论参考依据，同时为药肥复合生物制剂的研制提供有力的理论基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试材料。供试农药：97%噻虫嗪原药，由河北德瑞化工有限公司生产。微生物菌剂样品：河北滨海农产品有限公司提供的兰花专用微生物菌剂(主要成分胶冻样类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)。

1.1.2试剂。葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、氯化铁、琼脂等试剂均为国产分析纯和生化试剂。

1.1.3培养基。1号检测培养基(胶冻样类芽孢杆菌)：蔗糖(或绵白糖)5 g/L，Na2HPO42 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO30.1 g/L，FeCl30.1 g/L，琼脂 20 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。

2号检测培养基(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂17 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。

1.2仪器恒温振荡培养箱(HZQ-F160，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；电子天平(FA1004，上海天平仪器厂)；全自动高压灭菌锅(LDZX-70KBS，上海申安医疗器械厂)；恒温培养箱(GNP9080，杭州市汇尔仪器有限公司)； 超净工作台(VS-1300L-U，济南博鑫生物技术有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1噻虫嗪平板的制备。空白对照平板(CK)：不添加噻虫嗪的1号检测培养基和2号检测培养基经121 ℃、30 min高压灭菌后制备的平板。

噻虫嗪平板(T)：每100 mL 2号检测培养基分别加入0.1、0.2、0.3、0.4 g噻虫嗪，分装于250 mL三角瓶内，121 ℃，30 min高压灭菌冷却后倒平板，制成噻虫嗪浓度为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的噻虫嗪平板，每个处理设3次重复。每100 mL 1号检测培养基分别添加0.005、0.050、0.100、0.200 g的噻虫嗪，同上述 2号检测培养基制法，制成噻虫嗪浓度为0.005%、0.050%、0.100%和0.200%的噻虫嗪平板，每个处理设3次重复。

1.3.2菌悬液制备。称取样品10 g(精确到0.01 g)，加入带玻璃珠的100 mL磷酸盐缓冲液中，充分摇匀分散后静置20 min，在旋转式摇床上200 r/min充分振荡1 h，即成母液菌悬液。用无菌移液管分别吸取1mL上述母液菌悬液，加入9 mL磷酸盐缓冲液中，按1→10进行系列稀释，分别得到10，102，103，104，…，106倍稀释的菌悬液(每个稀释度应更换无菌移液管)，照此方法依次稀释3个菌株的9份样品。

1.3.3加样及培养。在无菌超净台上用移液器分别吸取10-6菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的1号、2号固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将稀释的菌悬液均匀地涂于琼脂表面，重复3次。将接种菌悬液的培养皿倒置于34 ℃恒温箱中培养。每24 h取出调查菌落的数目，直至不再长出新菌落为止。

1.4数据分析运用Excel软件进行数据统计分析，在上述条件下对3个菌株共获得的45组225个试验的菌落数量数据，计算各组菌落数量的算数平均值，抑制率=(对照培养菌株菌落数量-对峙培养菌株菌落数量)/对照培养菌株菌落数量×100%。

2 结果与分析

2.1噻虫嗪对胶冻样类芽孢杆菌YH-001的抑菌结果利用平板对峙法进行抑菌试验，噻虫嗪对胶冻样类芽孢杆菌YH-001的生长有较强的抑制作用，菌落数量随着噻虫嗪浓度的增加而减少。不同浓度噻虫嗪处理间比对照差异达极显著水平，重复之间差异不显著(表1～2，图1)。由表1可知，在0.050%浓度下对菌落生长影响不大，但是在0.200%的浓度时，完全抑制了菌落的生长，4个处理浓度抑制率分别达到10%、10%、60%和100%。由图1可以看出，经平板对峙培养48 h 后，不同浓度噻虫嗪培养基上胶冻样类芽孢杆菌菌株数量逐渐稀少，3次重复样品间菌落数量变化趋势一致。

表1 噻虫嗪对胶冻样类芽孢杆菌YH-001的抑制作用

表2不同浓度处理YH-001的菌落数差异分析

Table2AnalysisofthenumberofcoloniesofYH-001treatedwithdifferentconcentrations

差异源Difference Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedomF值F valueP值P valueF0.05处理间Dif-ferent treat-ments5 452.0174113.031 14.51E-073.837 853重复间Dif-ferent re-peated27.457 3321.138 490.367 1964.458 970误差Error96.469 338---总计Total5 575.94314---

2.2噻虫嗪对枯草芽孢杆菌YH-002的抑菌结果噻虫嗪对枯草芽孢杆菌YH-002的生长没有抑制作用，菌落数量随着噻虫嗪浓度的增加变化不大。不同浓度噻虫嗪处理间与对照差异显著，重复之间差异不显著(表3～4，图2)。由表3可知，在0.1%、0.2%、0.3%和0.4%浓度下，抑制率分别为0.29%、8.41%、6.67%和8.89%。由图2可以看出，经平板对峙培养48 h 后，不同浓度噻虫嗪培养基上枯草芽孢杆菌菌株数量变化不明显，3次重复样品间菌落数量变化趋势一致。

2.3噻虫嗪对地衣芽孢杆菌YH-003的抑菌结果噻虫嗪对地衣芽孢杆菌YH-003的生长有明显的抑制作用，菌落数量随着噻虫嗪浓度的增加而逐渐减少。不同浓度噻虫嗪处理间比对照差异达到极显著水平，重复之间差异不显著(表5～6，图3)。由表5可知，噻虫嗪在0.1%、0.2%、0.3%和0.4%浓度下，抑制率分别达到2.13%、10.59%、20.21%、30.85%。由图3可以看出，经平板对峙培养48 h 后，地衣芽孢杆菌菌株数量随噻虫嗪浓度的增高而减少，3次重复样品间菌落数量变化趋势一致。

图1 噻虫嗪对胶冻样类芽孢杆菌YH-001的抑制作用Fig.1 Inhibition of different concentrations of thiamethoxam in colonies of P.mucilaginous YH-001

处理Treatment噻虫嗪浓度Thiamethoxam concentration%菌落数Colony count∥个ⅠⅡⅢ平均Average抑制率Inhibition rate%CK0367348322345—T10.13443373513440.29T20.23293043163168.41T30.33233113313226.67T40.43392983053148.99

表4不同浓度处理YH-002的菌落数差异分析

Table4AnalysisofthenumberofcoloniesofYH-002treatedwithdifferentconcentrations

差异源Difference Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedomF值F valueP值P valueF0.05处理间Dif-ferent treat-ments2 845.90543.958 3830.046 4273.837 853重复间Dif-ferent re-peated1 159.87323.226 5470.093 8684.458 970误差Error1 437.9138---总计Total5 443.69114---

3 讨论

由于微生物制剂对全球农业和环境有重要贡献，微生物制剂的研究、生产及使用也呈井喷式增长。据海外研究机构近日公布的《全球农业微生物制剂市场报告》，2017 年全球农用微生物制剂的销售额约为30.9亿美元，预计到2022年将达到60.1亿美元，复合年增长率为14.21%[9]。微生物制剂的市场需求促进了中外学者对其的研究，但微生物制剂在农业领域多数研究多侧重于防治作物病害的机制原因、生产堆肥和提高产量等方面[10]，对微生物制剂中微生物本身对土壤中农药残留降解和与化学肥料、农药兼容性等问题还有待深入研究[11]。该试验从菌种的抗性出发，探索其与其他植保产品协同作用的效果，着重研究不同浓度噻虫嗪对“叶虹时光”3个功能菌株的抑菌影响，总体来看，噻虫嗪对3种叶虹时光功能菌株的抑制强弱顺序为胶冻样类芽孢杆菌>地衣芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌。目前，市场上的杀虫剂种类繁多，按其有效成分可分为有机氯、有机磷、拟除虫菊酯类、烟碱类、甲脒类杀虫剂等[12]。国内外有大量关于杀虫剂对土壤酶活性及土壤微生物影响的研究[13]，但对微生物肥料的影响研究还鲜见报道。微生物菌剂发挥效果受温度、湿度、土壤pH和光照等很多环境条件的影响，该试验中噻虫嗪在田间对微生物菌剂的影响还有待进一步研究。另外，其他影响噻虫嗪对叶虹时光兰花专用微生物菌剂3个功能菌株抑菌的因素还有噻虫嗪复配的药剂、乳化剂、使用时期等，这些因素的影响也在进一步探讨中。因此，噻虫嗪对3种常用生防菌株的拮抗影响研究可成为筛选经济、高效药肥复合生物制剂的一部分，具有广阔的市场前景。

图2 噻虫嗪对枯草芽孢杆菌YH-002的抑制作用Fig.2 Inhibition of different concentrations of thiamethoxam in colonies of B.subtilis YH-002

处理Treatment噻虫嗪浓度Thiamethoxam concentration%菌落数Colony count∥个ⅠⅡⅢ平均Average抑制率Inhibition rate%CK0102928994-T10.1998790922.13T20.28389848510.59T30.37678727520.21T40.46169666530.85

表6不同浓度处理YH-003的菌落数差异分析

Table6AnalysisofthenumberofcoloniesofYH-003treatedwithdifferentconcentrations

差异源Difference Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedomF值F valueP值P valueF0.05处理间Dif-ferent treat-ments1 758.326417.296 2700.000 5293.837 853重复间Dif-ferent re-peated41.220.810 5510.478 0364.458 970误差Error203.318 58---总计Total2 002.84414---

图3 噻虫嗪对地衣芽孢杆菌YH-003的抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentrations of thiamethoxam in colonies of B.licheniformis YH-003