miR-19b 通过激活Akt 信号通路保护心肌细胞凋亡

朱宏文, 喻溥蛟, 许嘉鸿

(1. 上海市安亭医院心血管内科, 201805; 2. 同济大学附属同济医院心血管内科, 上海200065)

缺血性心脏病是常见的心血管疾病之一, 其致死率和致残率较高, 严重危害人类健康. 目前已知的治疗缺血性心脏病最有效的方法是及时有效地恢复心脏血流, 即再灌注治疗[1]. 然而, 再灌注的治疗过程会对已经发生缺血的心肌细胞造成进一步损害, 包括心肌细胞功能异常和细胞死亡, 这种心肌短时间内血流供应中断, 在一定时间恢复血流后, 原本已经缺血的心肌会发生更为严重的损伤, 称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2]. MIRI 的机制目前尚不清楚, 通常认为与炎症、钙超载、氧自由基的释放等有关[3-6].目前, 依然缺乏有效的减轻MIRI 的方法[7], 因此寻找防治MIRI 的有效措施具有十分重要的意义.

微小RNA(microRNAs 或miRNAs)是高度保守的非编码基因序列, 通常有21∼23 个碱基参与转录后水平的调控, 多项研究表明miRNAs 在MIRI 发生发展过程中起到十分关键的调控作用[8-10]. miR-19b 是miR-17-92 基因簇的关键成员之一, 在肿瘤研究中miR-17-92 基因簇具有重要的抗凋亡作用[11]. 另外有研究报道, miR-19b 在心肌细胞中高表达并且为调控心肌增殖的重要分子[12], 这提示miR-19b 可能在心脏生理病理过程中发挥重要作用, 但是目前miR-19b 在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚不清楚. 本工作探讨miR-19b 在新生大鼠心肌细胞氧糖剥夺复氧(oxygen glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模型中的作用及其相关分子机制.

1 实验材料和方法

1.1 提取新生大鼠心肌细胞

用消化酶分解法提取新生大鼠心肌细胞, 75%酒精消毒后, 眼科剪摘取乳鼠心脏, 去除大血管及心房后在超净台中剪碎; 加入消化液在37◦C 摇床上震荡消化, 每隔30 min 换一次消化液, 直至组织块完全消失; 每次收集上清以马血清终止消化, 离心后去上清, 以重悬细胞团块, 用孔径为100 µm 的一次性筛网过滤掉胶原纤维等; 用“8”字法摇培养皿, 然后放入细胞培养箱差速贴壁30∼60 min, 将差速贴壁后的细胞悬液(未贴壁细胞)吸取到50 mL 离心管中,1 000 r/min, 离心5 min, 弃上清; 用温育的1×ADS(adenosine 5’-triphosphate disodium salt)重悬细胞, 运用Percoll 法获得高纯度的心肌细胞, 用原代心肌细胞培养基(DMEM(dulbecco’s modified eagle edium)+5%胎牛血清+10%马血清+1%双抗)重悬细胞, 并按实验计划所需的细胞密度布板, 细胞贴壁后进行转染处理.

1.2 细胞转染

细胞贴壁后进行转染处理, 用无血清培养基稀释miR-19b 模拟物(mimics)(终浓度50 nmol/L)、miR-19b 抑制物(inhibitor)(终浓度100 nmol/L)以及同源磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)-siRNA(终浓度75 nmol/L), Lipofectamine-2000助转染, 转染6∼8 h 后换液(无血清培养基).

1.3 OGD/R 模型建立

在细胞转染处理步骤结束20 h 时, 将细胞用无糖培养基(Gibco, 11966-025 公司)换液, 细胞板放入缺氧盒, 并在缺氧盒中同时放入缺氧袋(三菱电机(广州)压缩机有限公司), 培养箱孵育8 h 后, 换成原代心肌细胞培养基, 复氧复糖12 h.

1.4 α-actinin 与TUNEL 共染

在实验终点从培养箱取出细胞培养板, 弃掉培养基, 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 4%的多聚甲醛固定细胞, 室温, 20 min; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 0.2% 的Trition X-100 破膜, 室温, 20 min; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS,10%山羊血清封闭, 室温, 1 h; 吸尽封闭液,用10%山羊血清稀释一抗, 孵一抗(α-actinin), 4◦C, 过夜孵育; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 10%山羊血清配制荧光二抗(cy3-anti-mouse),室温,摇床孵育2 h(从此步骤开始全程避光);PBS 洗3 次,每次5 min;按照试剂盒(Vozyme, A111)说明书染TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-triphosphate-biotin nick end labeling), 结束后PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 用PBS 配制Hoechst, 染核, 室温, 20 min; 到荧光显微镜下观察和拍摄.

1.5 蛋白质免疫印迹法

在实验终点将细胞板中的培养基吸尽, PBS 洗1 次, 吸尽PBS, 加入适量裂解液, 用细胞刮将贴壁细胞刮下来, 吸取至EP(eppendorf) 管, 冰上裂解细胞40 min 后, 4◦C,14 000 g 离心20 min, 取上清液, 酶标仪测定蛋白样品的浓度后, 定容定量, 保证每次上样量一致. 加入5× 蛋白上样缓冲液, 震荡混匀, 100◦C 水浴或者金属浴热变性5∼10 min.配置十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacry lamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶, 等蛋白样品冷却到室温后, 将其直接上样到SDS-PAGE 加样孔内. 100 V 恒压电泳90 min, 结束后转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,用含5%脱脂奶粉的TBST(tris-buffered saline and tween)缓冲液封闭2 h, 一抗孵育, 4◦C孵育过夜. TBST 洗3 次, 每次10 min. 加入二抗, 摇床上室温孵育2 h, TBST 洗3 次, 每次10 min. 最后迅速以ECL(enhanced chemiluminescent)发光液于膜上反应约1 min, 化学发光仪扫描并分析图片.

1.6 统计学分析

用SPSS 24.0 统计软件进行分析, 数据均采用“均值±标准差”表示, 组间比较采用单因素方差分析(one way analysis of variance), 两组间比较采用独立样本t 检验分析方法. P <0.05表示差异有统计学显著性.

2 实验结果

2.1 miR-19b 对OGD/R 诱导的心肌细胞凋亡有保护作用

图1 TUNEL 法检测OGD/R 模型中转染miR-19b mimics 和miR-19b inhibitor 后的新生大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiac myocytes, NRCM)凋亡水平Fig.1 Apoptosis of NRCM transfected by miR-19b mimics and miR-19b inhibitor in the OGD/R model as determined by TUNEL assay

图2 新生大鼠心肌细胞OGD/R 模型中转染miR-19b mimics 后凋亡蛋白表达水平Fig.2 Apoptosis protein expression of NRCM transfected by miR-19b mimics in the OGD/R model

图3 新生大鼠心肌细胞OGD/R 模型中转染miR-19b inhibitor 后凋亡蛋白表达水平Fig.3 Apoptosis protein expression of NRCM transfected by miR-19b inhibitor in the OGD/R model

本工作利用TUNEL 法和蛋白质免疫印迹法检测心肌细胞氧糖剥离再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)诱导的新生大鼠心肌细胞凋亡水平(见图1∼3).TUNEL 染色结果显示, 转染miR-19b mimics 可缓解OGD/R 诱导的心肌细胞凋亡, 而miR-19b inhibitor 可进一步加重OGD/R 诱导的心肌细胞凋亡(见图1). 图1 中, Nc 表示空白对照,*表示P < 0.05, n=4. 同时, 蛋白质免疫印迹法结果表明, 在OGD/R 模型中, 转染miR-19b mimics 可使Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率均降低(见图2), 而转染miR-19b inhibitor 能够上调Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率(见图3). 这里, 图2 显示了在OGD/R 模型中转染miR-19b mimics 的蛋白质免疫印迹法结果, 其中*表示P <0.05, **表示P <0.01; n=3. 而图3 显示了在OGD/R 模型中转染miR-19b inhibitor的蛋白质免疫印迹法结果, 其中*表示P <0.05, ***表示P <0.001; n=3.

2.2 miR-19b 可通过负向调控PTEN 激活Akt 信号通路

本工作利用蛋白质免疫印迹法检测新生大鼠心肌细胞中PTEN、308 位点磷酸化Akt(pAkt308)和总Akt(tAkt)表达水平. 结果显示, 转染miR-19b mimics 后, PTEN 表达水平降低, pAkt308/tAkt 比率升高(见图4), 而转染miR-19b inhibitor 后, PTEN 表达水平升高,pAkt308/tAkt 比率降低(见图5). 这里,图4 显示了转染miR-19b mimics 后的PTEN、308位点磷酸化Akt(pAkt308)和总Akt(tAkt)蛋白表达水平结果, 其中*表示P < 0.05, n = 3. 图5 显示了转染miR-19b inhibitor 后的PTEN、308 位点磷酸化Akt(pAkt308)和总Akt(tAkt)蛋白表达水平结果, 其中*表示P <0.05, **表示P <0.01; n=3.

图4 NRCM 转染miR-19b mimics 后的PTEN、308 位点磷酸化Akt(pAkt308)和总Akt(tAkt) 蛋白表达水平Fig.4 Expression of PTEN, Phospho-Akt(Thr308) and total Akt in NRCM transfected by miR-19b mimics

图5 NRCM 转染miR-19b inhibitor 后的PTEN、308 位点磷酸化Akt(pAkt308)和总Akt(tAkt) 蛋白表达水平Fig.5 Expression of PTEN,Phospho-Akt(Thr308)and total Akt in NRCM transfected by miR-19b inhibitor

2.3 PTEN 是miR-19b 对OGD/R 诱导的心肌细胞凋亡发挥保护作用的关键分子

利用TUNEL 法检测OGD/R 诱导的新生大鼠心肌细胞凋亡水平. TUNEL 染色结果显示, PTEN-siRNA 可以降低OGD/R 诱导的心肌细胞凋亡水平, 且PTEN-siRNA 可逆转miR-19b inhibitor 对心肌细胞凋亡水平的促进作用(见图6, 图中**表示P < 0.01, n = 4). 本工作设计了2 条PTEN 的siRNA(PTEN-siRNA4 和PTEN-siRNA5).

图6 TUNEL 法检测NRCM 转染miR-19b inhibitor 和/或PTEN-siRNA 后的凋亡水平Fig.6 Apoptosis of NRCM transfected by miR-19b inhibitor and/or PTEN-siRNA as determined by TUNEL assay

3 讨 论

miR-17-92 是目前被研究得最多的miRNA 基因簇, 而miR-19b 是该基因簇的关键成员之一. 除了在乳腺癌和肝细胞癌等肿瘤发生发展过程中发挥促增殖和抗凋亡作用外[13-14],miR-19b 在心血管疾病的调控中也起重要作用, 包括动脉粥样硬化、心脏纤维化、心肌肥厚等[15-17].

本工作构建了新生大鼠心肌细胞氧糖剥离再灌注(OGD/R)模型, 模拟心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的过程; 利用miR-19b mimics 和miR-19b inhibitor 来过表达和抑制miR-19b 的表达; 运用TUNEL 法和蛋白质免疫印迹法来检测心肌细胞凋亡水平. 结果表明, miR-19b mimics 可降低OGD/R 模型诱导的心肌细胞凋亡, 而miR-19b inhibitor 作用则相反. 凋亡蛋白表达水平(Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率)检测结果也与TUNEL 染色结果一致, 那么miR-19b对心肌细胞凋亡的保护作用是通过哪个下游靶点实现的呢？已有研究发现, PTEN 是miR-19b 的下游靶基因之一, PTEN 可通过将PI3K 去磷酸化, 来抑制Akt 信号通路, 而PI3K-Akt 通路是MIRI 的经典调控通路之一[18-20]. 本工作通过蛋白质免疫印迹法检测PTEN 和Akt 磷酸化, 明确了miR-19b 可下调PTEN 的作用, 从而激活Akt 信号通路.另外, 功能逆转实验也证实了PTEN 的确是miR-19b 保护心肌细胞凋亡的关键下游分子, 因此本工作的结论是, miR-19b 可通过下调PTEN、激活Akt 信号通路, 从而保护OGD/R 模型诱导的心肌细胞凋亡.

另外, 本工作还存在很多不足之处: ①尚有待进一步进行动物整体水平的功能研究; ②分子间相互作用机制的研究较为浅显. 在后续研究中, 将进一步完善动物实验, 并将进一步深入探究分子间相互作用的机制.

总之, 本工作揭示了miR-19b 在OGD/R 模型诱导的心肌细胞凋亡中的保护作用及其分子机制, 为后续的体内实验提供一定的研究基础, 也为将来心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的潜在干预靶点.