小鼠非酒精性脂肪性肝炎中线粒体功能的障碍

后文琳, 潘 雯, 付思艺, 宋美怡, 王 菲

(1. 上海大学生命科学学院, 上海200444; 2. 同济大学附属同济医院消化内科, 上海200065)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指脂肪在肝内积累超过肝脏总重的5%∼10%, 同时出现弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性. 病变主要是从单纯性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)发展至非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 最后发展为非酒精性肝硬化(non-alcoholic cirrhosis, NAC)直至肝癌[1]. NAFLD 的进展是一个连续的过程, 最初NAFL 病变部位为肝小叶, 此时出现脂滴的肝细胞超过30%, 无其他组织学改变. NASH 是NAFL 的延续, 在肝细胞脂肪变性的基础上发生以肝细胞气球样变、弥散性肝小叶炎症为病理特征的慢性肝炎[2-3]. NASH 的相关肝硬化是长期炎症导致的损害, 其病理结构可见肝细胞大量坏死、肝小叶结构破坏、纤维瘢痕形成以及肝组织变性等. NAFLD 的发病因素包括肥胖、糖代谢紊乱、高血压、饮食结构的改变[4-5]等, 目前已成为我国最常见的肝脏疾病, 且发病率呈逐年上升的趋势, 因此NAFLD 是近年来研究的主要热点之一[6].

这几年, NAFLD 被发现与线粒体功能障碍密切相关, 线粒体的功能在NAFLD 的发病和进展过程中起着重要作用[7-8]. 事实上, 早在1976 年Huttenlocher 等[9]就将肝脏疾病与线粒体疾病联系在一起; 2012 年Gomez-Zorita等[10]研究发现, 白藜芦醇可激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)的通路来降低氧化应激, 减少肝脂肪生成, 从而改善肝脂肪变性. 由于胆碱蛋氨酸缺乏(methionine choline deficient, MCD)饮食诱导的小鼠模型早期会出现肝细胞脂肪变性, 且后期会逐渐出现肝细胞炎性反应及纤维化反应, 故在国际上公认是成功复制NASH 模型之一[11]. 本工作旨在通过检测小鼠NASH 模型中线粒体功能的变化, 探讨线粒体对NASH 病变过程的影响, 从而研究其中可能的分子机制, 为预防及治疗NASH 提供新的分子靶点.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性C57BL/6 小鼠,8∼10 周龄,质量为(28±1)g,饲养于上海大学SPF(specific pathogen free)级动物房, 温度(22±2)◦C, 湿度50%∼60%. 所有操作均遵守美国国立卫生院(National Institutes of Health, NIH)的相关规定.

1.1.2 实验仪器

分光光度计, 微量移液器, 旋涡混匀器, 全自动生化分析仪, 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)仪, 实时荧光定量PCR(quantification real-time PCR, qRT-PCR)仪,Nano Drop 测定仪.

1.1.3 材料

采用胆碱蛋氨酸充足(methionine choline sufficient, MCS)作为对照组饲料[12], 选用胆碱蛋氨酸缺乏(methionine choline deficient, MCD)组饲料作为实验组饲料[11]. 在MCS 饮食配方上减去胆碱2 g/kg、蛋氨酸3 g/kg(饲料均由江苏南通特洛菲饲料有限公司提供); HE(hematoxylin-eosin)染色相关试剂购于美国Sigma 公司; 丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、总胆固醇(total cholesterol, TC)测定和甘油三酯(triglyceride, TG)测定试剂盒均购于南京建成生物公司; PCR 相关试剂Trizol、反转录试剂盒和SYBR Green 购于Takara 公司; 384 孔PCR 板购于Roche 公司.

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验方案

采用MCD 饮食构建小鼠NASH 模型,其对照组喂食MCS 的饲料. 8∼10 周的C57BL/6 小鼠随机分为2 组: MCS 对照组(n = 6)和MCD 实验组(n = 6), 分别不间断喂食4 周. 对照组以MCS 饲料喂养, NASH 模型组以MCD 饲料喂养. 4 周后, 禁食不禁水, 次日称体重后, 腹腔注射麻醉, 固定打开腹腔, 采取下腔静脉采血, 迅速游离并取出肝脏, 预冷生理盐水冲尽血迹后, 称量肝脏湿质量, 计算肝指数(肝指数=肝质量/体质量×100%). 取部分肝组织用4%多聚甲醛固定, 其余−80◦C 冰箱保存.

1.2.2 血清生化指标检测

利用试剂盒检测小鼠血清中ALT(南京建成生物公司, C009-3)、AST(南京建成生物公司,C010-1)、TC(南京建成生物公司, A111-2)和TG(南京建成生物公司, A110-2)的相关水平.

1.2.3 HE 染色

二甲苯梯度酒精脱蜡; 1×PBS 洗3 遍, 每次5 min; 蒸馏水轻洗1∼2 min, 用力甩掉水分;核染液染色5 min, 水洗3∼5 s; 浆液染色20 s; 增色液冲洗1 次, 自然晾干; 封片后于Leica 生物显微镜下观察.

1.2.4 DNA 的提取

通过DNeasy Blood & Tissue 试剂盒(德国Hilden Qiagen 公司)提取总DNA, 包括线粒体DNA(mtDNA)和核内基因组DNA(nDNA).

1.2.5 RNA 的提取

运用Trizol 试剂(日本Takara 公司)抽提总RNA, 使用Nano Drop 仪测定RNA 的浓度和纯度.

1.2.6 荧光定量PCR

通过Trizol-异丙醇法提取小鼠肝脏组织的RNA, 将RNA 逆转录为cDNA 后检测基因mRNA 水平的表达, 取1µg 的总RNA, 加入5×逆转录试剂2µL, 利用DEPC(diethyl pyrocarbonate)水将总体积补充到10 µL, 并利用合成的cDNA 和特异性的PCR 引物检测目标mRNA 的表达,扩增的DNA 产物以SYBR Green 标记,采用18S 作为内参基因,以2−∆∆CT的计算方法进行相对表达量计算. 本工作采用的引物序列如表1 所示.

表1 qRT-PCR 引物序列Table1 Sequences of the primers for qRT-PCR

1.2.7 统计方法

运用SPSS 20.0 统计软件进行分析, 实验数据均采用“均值±标准差”方法表示, 分析前进行方差齐性检验. 当满足条件时,选用独立样本t 检验进行2 组间比较,P <0.05 表示有统计学差异.

2 结 果

2.1 MCD 饮食诱导的NASH 模型的建立

经过MCD 饲料喂养的的小鼠体重、肝重、肝重/体重、腹股沟脂肪、腹股沟脂肪/体重、附睾脂肪、附睾脂肪/体重、肩胛骨脂肪较MCS 组显著下降, 肝重/体重(肝指数)、肩胛骨脂肪/体重无明显差异(见表2)，这说明MCD 喂食成功诱导了NASH 的发生.

表2 经过4 周MCD 饮食后小鼠的特征Table2 Characteristics of mice after four weeks of experimental diets

2.2 MCD 小鼠生化指标和肝组织病理学形态的变化

与对照组相比, MCD 组小鼠血清中ALT 和AST 活性、肝脏组织中TG 水平较MCS 组显著提高(见图1(a)∼1(c)), 而TC 水平降低(见图1(d)). 此外, HE 染色情况下在光学显微镜下可见对照组小鼠肝小叶结构清晰, 未见脂肪变性及炎症细胞浸润; 而MCD 组在光学显微镜下可见肝组织变性严重, 有大量脂肪空泡, 小叶结构破坏严重, 炎细胞浸润明显(见图1(e)), 进一步证实了模型构建成功.

2.3 MCD 小鼠中线粒体功能的变化

成功构建小鼠NASH 模型后, 本工作采用qRT-PCR 分别检测了小鼠肝脏组织中mtDNA(mitochondrial DNA, mtDNA)和nDNA(nuclear DNA, nDNA), 结果显示MCD 组mtDNA/nDNA 表达量明显降低(见图2(a)), 说明MCD 组小鼠肝脏线粒体的mtDNA/nDNA 的值降低. 同时检测线粒体DNA 复制相关的基因(POLG, SSBP1, TWINKLE 和TOP1MT)的表达变化发现, TOP1MT 的表达量明显降低, POLG, SSBP1 和TWINKLE 表达无明显差异(见图2(b)), 这说明线粒体的生成能力受到影响. 然后检测线粒体DNA 编码的参与能量代谢的基因(ND1, ND2, ND6, COX1, COX2, 16S rRNA, ATPase6 和CYTB)的表达变化. 结果发现, 与对照组相比, MCD 组中在线粒体DNA 编码的参与能量代谢的基因中, MCD 组中ND1,ND6, COX1, COX2, 16S rRNA 和CYTB 的表达量明显降低(见图3), 说明MCD 饲养的小鼠肝组织线粒体的mtDNA/nDNA 值降低, 功能受到损伤.

图1 MCD 饮食对肝脏中血脂和转氨酶水平和肝脏病理形态的影响(**: P<0.01, ***: P<0.001;n=6)Fig.1 Effects of the MCD diet on serum lipids,transaminase levels and hepatic pathological changes in liver (**: P<0.01, ***: P<0.001; n=6)

图2 线粒体DNA 和线粒体DNA 复制的基因的表达水平(*: P<0.05, ***: P<0.001; n=6)Fig.2 Expressions of mtDNA replication-related genes and mitochondrial DNA(*: P<0.05,***: P<0.001; n=6)

2.4 MCD 小鼠肝脏中能量代谢相关的PGC-1 信号通路中相关基因的变化

采用qRT-PCR 检测NASH 小鼠肝脏中能量代谢相关的PGC-1 通路相关的基因(PGC-1α, PGC-1β, NRF1, NRF2A, NRF2B2, TFAM, TFB1M 和TFB2M). 结果发现, 与对照组相比, MCD 组中PGC-1β, NRF1, NRF2A, NRF2B2, TFAM, TFB1M 和TFB2M 表达水平均明显降低, 但PGC-1α 表达水平无明显差异(见图4). 事实上, 与PGC-1α 相比, 在高呼吸活性的细胞中PGC-1β 呈现高表达[13], 这说明MCD 组的能量代谢能力减弱.

图3 线粒体DNA 编码参与能量代谢相关基因的表达水平(*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001;n=6)Fig.3 Expression levels of genes involved in energy metabolism encoded by mitochondrial DNA (*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001; n=6)

图4 在肝脏中调控PGC-1 通路相关基因的表达水平(*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001; n=6)Fig.4 Regulation of PGC-1 pathway related gene expression in the liver (*: P<0.05, **:P<0.01, ***: P<0.001; n=6)

3 讨 论

NAFLD 是临床常见的疾病之一, 是一种由多种疾病或者因素引起的以肝脏脂肪积蓄过多为特征的慢性疾病, 其15%∼25%的病历可发展为肝硬化[14-15]. NASH 作为NAFLD 病程中最关键的环节, 是单纯性脂肪肝发展为肝纤维化和肝硬化的必经阶段[16], 因此对NASH 的发病机制的研究和防治就显得格外重要[17].

越来越多的研究证明, 线粒体功能障碍会诱导肝脏炎性反应、肝细胞坏死和肝纤维化的发生[18], 进而导致NASH 的发生和发展. 众所周知, 线粒体是真核细胞能量代谢过程中重要的细胞器之一, 是ATP 产生的主要场所, 在细胞内分裂和融合的动态结构中起平衡作用[19]. 据报道, 当线粒体受损时膜电位下降从而导致ATP 合成减少, 肝细胞质膜发生脂质过氧化损伤, 进而导致NASH 的发生[20].

在本工作中可以发现, 在MCD 饲料喂养的小鼠组中, 线粒体的mtDNA/nDNA 和编码的基因(ND1,ND2,ND6,COX1,COX2,16S,ATPase6 和CYTB)线粒体复制相关基因(POLG,SSBP1, TWINKLE 和TOP1MT)表达水平出现降低的情况, 这表明线粒体数量和功能的降低可能对NASH 的发病起到了促进作用; 同时, 从PGC-1 介导的能量代谢来看, PGC-1 通路中PGC-1β, NRF1, NRF2A, NRF2B2, TFAM, TFB1M 和TFB2M 表达水平降低, 表明能量代谢能力降低.

在MCD 饮食诱导的NASH 模型中, 小鼠肝脏中线粒体的生成、维持线粒体的功能和激活PGC-1 途径均受到阻碍, 可见线粒体的数量及功能障碍与NASH 发病密切相关, 并会导致NASH 进程加快. 根据此研究, 通过促进线粒体的生成可能是治疗NAFLD 的一种方法, 为临床治疗提供新的思路.