响应面酶法辅助超声提取芫荽总黄酮的工艺研究

刘芸，胡美忠，任慧婧，莫正昌，郁建生

（1.贵州轻工职业技术学院 化工系，贵阳 550025；2.贵州省中兽药工程研究中心，贵州 铜仁 554300；3.铜仁职业技术学院 药学院，贵州 铜仁 554300）

芫荽（Coriandrum sativumL.），一、二年生伞形科草本。辛香升散，可促肠胃蠕动，助开胃醒脾，又可内通心脾外达四肢，止痛解毒。除了是人们所熟悉的调味品外，它还具有很高的药用价值。芫荽在古代就是调味和药用最古老的芳香蔬菜之一［1］，在食品的烹调和摆盘中可起到画龙点睛的作用，在药品中的作用也不容小觑。芫荽除了含有平常植物所含有的蛋白质、多糖、维生素等成分外，还含有挥发性油、黄酮等药用成分，并且挥发性油、黄酮是芫荽能用于调味食品及药用的主要物质［2－6］，黄酮还对植物呈色有一定作用，关注并研究其有效成分黄酮显得尤为重要。目前，对于芫荽挥发油研究的较多，黄酮、香豆素文献较少。

植物细胞拥有坚硬的细胞壁，是阻碍有效成分从植物细胞中大量溶出的重要因素。细胞壁的主要成分为纤维素，纤维素可被纤维素酶有效降解。而超声波提取技术具有快速、廉价和高效的特点，广泛应用于多种天然产物的提取［7］。现将这两种技术联用，用适宜的酶和超声对植物进行处理［8］，继而再用适宜的有机溶剂进行有效成分的提取。这种方法具有环保高效、时间短、反应条件温和等优点，符合社会发展的主流方向［9，10］。目前，王顺民等［11］研究了超声波协同双水相体系提取芫荽总黄酮，刘韬等［12］研究了总黄酮的微波提取工艺，刘恒蔚等［13］对比了香菜的乙醇回流和超声波辅助提取工艺。本文首次将超声波法和酶法联用应用在芫荽的提取中，再通过响应面分析建立数学模型，确定最优的酶解工艺条件，期待为今后进一步开发利用芫荽黄酮甚至改良其调味效果提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

芫荽（经铜仁职业技术学院中药教研室鉴定）：去根洗净，50℃恒温干燥，粉碎，过40目筛；芦丁标准品（100080-201610）：购于中国食品药品检定研究院；其他试剂：市售，分析纯；纤维素酶（酶活力20U／mg）：上海谱振生物科技有限公司。

1.2 仪器

TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Agilent110高效液相色谱仪 美国Agilent公司；HMC-WS10纯水机 韩国Human公司；KQ-500DE台式数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH-6A电热恒温水浴锅 北京科伟永兴实验仪器设备厂；pHS-25酸度计 上海雷磁仪器厂；WH-861涡旋混合器 上海环球物化仪器厂；Mettlerae 240十万分之一电子天平 德国梅特勒-托利多公司；RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的配制

参照方法文献［2］和文献［13］的方法进行改进，精密称定对照品适量，加30%乙醇溶液溶解并定容至10mL，超声3min，制得含芦丁0.25712mg／mL对照品储备液Ⅰ。

精密吸取对照品储备液Ⅰ0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL配制系列浓度的芦丁溶液。加5%NaNO20.3mL，涡旋2min，放置5min。加10%Al（NO3）3，涡旋2min，放置6min。加4.0%NaOH 2.0mL，乙醇定容至10mL，涡旋2min，放置15min。在510nm波长下测定其吸光度，得芦丁浓度C与吸光度A的回归方程，标准回归方程：C＝10.520A－0.0023，R2＝0.9993。

2.1.2 醇提供试品的制备

参考文献［12］和文献［13］的方法进行改进，芫荽加乙醇浓度70%，液料比25∶1，60℃，350W超声45min，放冷，收集提取液并浓缩定容至50mL，涡旋3min，过滤，得醇提供试品储备液。将储备液稀释，按2.1.1项下条件显色，即得供试品溶液Ⅱ。

2.1.3 超声辅助酶解醇提供试品的制备

一定条件（酶用量、酶解pH值、酶解时间、酶解温度）下酶解，酶灭活，趁热过滤，减压浓缩。加乙醇达浓度为70%，60℃，350W 超声3min，放冷，收集提取液并浓缩70%乙醇定容至50mL，涡旋3min，过滤，得超声辅助酶解醇提供试品储备液。将储备液稀释，按2.1.1项下条件显色，即得供试品溶液Ⅲ。

2.1.4 液相供试液制备

取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，微孔滤膜过滤得芦丁标准品溶液Ⅳ；取2.1.3供试品储备液，乙腈定容。离心，上清液微孔滤膜过滤得芫荽药材溶液Ⅴ。

2.2 总黄酮收率计算

参照文献［2］的方法，总黄酮收率按照下式计算（以芦丁计）：

式中：C为总黄酮浓度，mg／mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数，M为总质量，g。

2.3 单因素试验设计

2.3.1 酶解温度

准确称取1.5g芫荽粉末，加入15mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，在酶解时间为20min、酶解pH值为5.0、酶用量为3.0mg／g的条件下，考察不同酶解温度（35，40，45，50，55℃）对总黄酮收率的影响。

2.3.2 酶解时间

准确称取1.5g芫荽粉末，加入15mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，在酶解温度为60℃、酶解pH值为5.0、酶用量为3.0mg／g的条件下，考察不同酶解时间（5，10，15，20，25min）对总黄酮收率的影响。

2.3.3 酶解pH 值

准确称取1.5g芫荽粉末，加入15mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，在酶解温度为60℃、酶解时间为20min、酶用量为3.0mg／g的条件下，考察不同酶解pH 值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）对总黄酮收率的影响。

2.3.4 酶用量

准确称取1.5g芫荽粉末，加入15mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，在酶解温度为60℃、酶解时间为20min、酶解pH值为5.0的条件下，考察不同纤维素酶用量（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mg／g）对总黄酮收率的影响。

3 结果与分析

3.1 高效图谱检测

参考文献［14］的方法进行改进，Agilent柱；流动相乙腈-0.1%冰醋酸（32∶68），流速1.0mL／min；波长257nm；进样量10μL；理论踏板数大于5000，峰形好，见图1。

图1 芦丁对照品溶液Ⅳ（A）和芫荽药材溶液Ⅴ（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of rutin reference solutionⅣ（A）and Coriandrum sativummedicinal solution Ⅴ（B）

3.2 响应面试验设计

基于前期单因素预试验的结果，根据Box-Benhnken试验设计原理，以芦丁收率（Y）为响应值，在酶解时间、酶解温度、酶解pH值、酶用量4个单因素的基础上采用4因素3水平的响应面分析方法进行试验设计，因素和水平设计见表1。

表1 响应面试验设计因素及水平表Table1 Factors and levels of response surface test design

3.3 酶法辅助超声提取芫荽中总黄酮的最佳工艺

3.3.1 响应面分析及试验结果

芫荽中总黄酮工艺响应面试验设计及结果见表2。对各因素进行回归拟合，得到二次回归方程：

Y＝2.19－0.008333A＋0.040B－0.086C－0.046D＋0.022AB＋0.017AC－0.015AD＋0.023BC＋0.005BD－0.0075CD－0.088A2－0.20B2－0.18C2－0.12D2。

利用Box-Benhnken的中心组合试验数据对该回归模型进行分析，结果表明：该模型达极显著水平，失拟项不显著。模型总决定系数R2＝0.9915，校正决定系数R2Adj＝0.9830，R2Pred＝0.9570。表明该模型方程拟合情况较好，该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系，试验方法可靠。该模型可用于超声辅助酶法提取芫荽中总黄酮的最佳工艺条件。

表2 响应面试验设计及数据处理Table2 Design and data processing of response surface test

由方差分析结果中的P值可知：B，C，D，A2，B2，C2，D2均对总黄酮收率影响极显著（P＜0.01）。A，AB，BC均对芫荽中总黄酮收率影响显著（P＜0.05），模型F＝106.66意味着该模型具有重要意义。以上各因素对总黄酮收率影响的顺序依次为：酶解pH值＞酶用量＞酶解温度＞酶解时间。FProb＜0.05，说明模型项是显著的。

根据回归模型绘制相应的响应曲面图。各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，两因素之间的交互作用对响应值影响与响应面的陡峭程度成正比，即交互作用对响应值影响强，则曲面越陡峭。反之则平缓，结果见图2。

图2 两因素交互作用对芦丁得率影响的结果Fig.2 Response surface of interaction between every two factors on extraction rate of rutin

由图2可知，酶解时间和酶解温度的交互作用、酶解温度和酶解pH值的交互作用对总黄酮收率影响显著。而其他交互项显著性相对较差，表明试验因素对曲面响应值是一种非线性的关系。

3.3.2 总黄酮最佳提取工艺条件的验证

通过Box-Benhnken分析优化，得到纤维素酶辅助超声提取芫荽总黄酮的最佳工艺条件为：酶解时间10.35min、酶解温度49.15℃、酶解pH 值4.89、酶用量1.87mg／g，在该条件下的总黄酮理论收率为2.19mg／g。为方便验证该方法的可行性，采用上述条件的调整值：酶解时间10min、酶解温度49℃、酶解pH 值4.9、酶用量1.9mg／g，对芫荽中总黄酮进行提取。结果表明：纤维素酶辅助超声提取芫荽总黄酮平均提取收率（n＝3）为2.15mg／g。试验结果与模型预测值相对误差为0.28%。对比醇提供试品总黄酮收率1.02mg／g，纤维素酶辅助超声提取法有效提高芫荽中总黄酮收率达52.6%。

4 小结

芫荽是人们喜欢的一种调味蔬菜，在临床上也有一定的食疗作用［15］，其富含的挥发性油、总黄酮化合物，引起了食品、医药等行业的兴趣。目前，芫荽总黄酮的提取主要采用乙醇提取法、超声提取法等。本研究以芫荽总黄酮收率为指标，结果表明纤维素酶辅助超声提取法相比，比醇提取法芫荽总黄酮收率高52.6%，且大大缩短时间。相对酶的各单因素试验结果而言，经过曲面法优化的工艺收率也是最高的。证明采用响应面法优化提取工艺方法可靠，本研究优选的提取芫荽总黄酮工艺具有提取效率高、环保等优点。高效液相色谱定性、定量更直观，在该实验中，还对其测定芦丁条件进行了摸索和改进。综上所述，本研究可为芫荽的研究及生产提供参考。一个佳肴的色、香、味离不开调味品，芫荽可以说是天然调味品中的佼佼者，历史悠久，发展前景广阔。