肉桂和八角精油联合抗菌作用研究

汪青青，李萍＊，赵鹏英，崔晶，松江勇次

（1.天津农学院 基础科学学院，天津 300384；2.天津中日水稻品质·食味研究中心，天津 300384；3.九州大学 全球创新中心，日本 福冈 812-8581）

近年来，植物精油的抗菌活性及其在果蔬保鲜领域的应用研究引起了人们广泛的兴趣。许多植物精油的抗菌活性已经被证实［1－3］。然而，植物精油用于果蔬保鲜面临的最重要问题是：即使在低浓度下精油也具有强烈的气味，这会对所处理果蔬的感官特性产生不利影响［4］。有报道称，精油的复配可以扩大抗菌谱，增强抗菌效果，从而减少使用剂量（浓度），降低精油气味给食品感官带来的负面影响。如Ju等［5］报道了肉桂和丁香精油及其复配物对绿豆蛋糕和手指香橼酥饼霉菌生长的抑制效果；张洪军等［6］报道了10μL大蒜和肉桂精油按照1∶2的比例复配添加到双孢菇PE膜包装袋中，可有效保持双孢菇的感官、Vc含量和总酚含量，降低褐变程度，将双孢菇的保鲜期延长2天；刘欢等［7］报道了500μL／L的肉桂醛／柠檬醛对采后葡萄灰霉菌的稳定抑制效果。肉桂油是从肉桂的皮、枝、叶中提取得到的黄色油状液体，对多种食源性致病菌和果蔬腐败性真菌具有较好的抑制效果［8，9］；八角油是从八角茴香果实中提取得到的浅黄色油状液体，具有较强的抗菌和抗氧化活性［10］，两者分别被中国GB 1886.207－2016和 GB 1886.140－2015 食品安全国家标准认定为安全的食品添加剂。然而，关于肉桂油和八角油的联合抗菌作用报道很少。因此，本研究采用琼脂-孔洞扩散法测定抗菌活性，利用2倍连续稀释法测定精油最小抑菌浓度，以分级浓度抑制指数作为评价指标考察肉桂和八角油的联合抗菌作用，并对两者的最佳抗菌复配比例进行选择，旨在通过精油的复配减弱各自的使用剂量（浓度），从而减少对食物感官特性的影响，有利于肉桂和八角精油在食品保鲜领域中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

肉桂油、八角油：江西吉安中大香料厂；乙酸乙酯（AR）：天津市津东天正精细化学试剂厂。革兰氏阴性细菌：大肠杆菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌；革兰氏阳性细菌：枯草芽孢杆菌；酵母菌：啤酒酵母、酿酒酵母。以上菌种均由天津农学院资源与环境学院微生物实验室提供，在4℃斜面保存，用前活化2次。

1.2 仪器与设备

DX-35BI型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；Thermo Scientific MSC-AdvantageⅡ级生物安全柜 德国 Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-S型恒温恒湿培养箱 广东省医疗器械厂。UV-1800型紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 琼脂-孔洞扩散法测定抗菌活性

供试样品溶液的配制：肉桂油、八角油分别用乙酸乙酯溶解，初始浓度为1000.0mg／mL，用乙酸乙酯作溶剂，采用2倍连续稀释法配成一系列不同浓度的样品溶液。

菌悬液的制备：细菌用平板计数法测定菌落数，酵母用血球计数法计算菌落数［11］。将活化后的细菌和酵母菌用无菌水稀释，分别制成含菌数为107cfu／mL的菌悬液。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（细菌用）；酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（酵母菌用）。

测定步骤［12］：灭菌培养基冷至50℃，加入5mL菌悬液，混匀，倒入培养皿中（直径9cm），每皿20mL，固化45min。用无菌打孔器在培养基上均匀打孔（直径9mm），记号。每孔加入40μL供试样品溶液，乙酸乙酯作空白对照，每个浓度重复3次。细菌于37℃培养24h，酵母菌于28℃培养48h。以十字交叉法测量抑菌圈直径，结果用平均值±标准差表示，单位mm。

最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）定义为可以完全抑制供试菌种生长的最低浓度。1.3.2 肉桂油和八角油联合抗菌作用评价

精油的联合抗菌作用分为：协同、相加、无相关和拮抗作用4种。采用二维棋盘试验测定肉桂油和八角油两者复配的联合抗菌作用［13］。肉桂油的供试浓度为：MIC，1／2MIC，1／4MIC，1／8MIC，1／16MIC；八角 油 的 供 试 浓 度 为：MIC，1／2MIC，1／4MIC，1／8MIC；两两组合，共20组。以分级浓度抑制指数（fractional inhibitory concentration，FIC）作为联合抗菌作用的判定依据。FIC按照如下公式计算：

FIC≤0.5：协同作用；0.5＜FIC≤1.0：相加作用；1.0＜FIC＜4.0：无相关作用；FIC≥4.0：拮抗作用。

1.3.3 肉桂油和八角油最佳抑菌复配比例的选择

选取对肉桂和八角复配精油敏感的供试菌种（即协同或相加作用），对精油最佳抑菌复配比例进行选择，体积比例（肉桂油∶八角油）分别设置为4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4。

2 结果与分析

2.1 肉桂油和八角油单方的最小抑菌浓度（MIC）

肉桂油和八角油单方对供试菌种的抑制效果见表1。

表1 肉桂油和八角油对供试菌种的抑菌圈直径（mm）Table1 The inhibition zone diameter（mm）of cinnamon oil and star anise oil on the tested strains

由表1可知，浓度为1000.0mg／mL的肉桂油对供试细菌的抑菌圈直径是相同浓度八角油的2.50～2.68倍，对供试酵母菌的抑菌圈直径是相同浓度八角油的2.77～2.97倍。说明在同一试验条件下，相同浓度的肉桂油抑菌效果好于八角油，这与 Wang等［14］的研究结果一致。肉桂油对供试酵母菌和细菌的MIC分别为31.25，125.0mg／mL，说明对酵母菌的抑制效果好于细菌，邓靖等［15］报道了相同的研究结果。此外，肉桂油对啤酒酵母的抑制效果优于酿酒酵母，而对6种供试细菌的抑制效果相差不大。八角油对供试酵母菌和细菌的抑制活性相差不大，MIC均为1000.0mg／mL。我们报道的肉桂油对大肠杆菌的抑菌圈直径（28.90±0.94）mm与柴向华等报道的一致［16］，而对啤酒酵母的抑制效果与柴向华等报道的相差较大。精油的抑菌活性受到多种因素影响，如来源、萃取方法、使用浓度、菌种、菌悬液浓度、抑菌活性评价方法等。

2.2 肉桂油和八角油的联合抗菌作用

采用二维棋盘试验将肉桂油和八角油供试浓度进行两两组合，得到两者联合使用时的最小抑菌浓度组合并结合两者各自的最小抑菌浓度计算FIC值，结果见表2。

表2 肉桂油和八角油联合抗菌作用Table2 Combined antibacterial effect of cinnamon and star anise oil

续 表

由FIC值可以判断，肉桂油和八角油联合使用对嗜水气单胞菌的抑制表现出协同作用（FIC＝0.375），对恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌表现出相加作用（FIC＝0.625），对大肠杆菌（FIC＝1.25）、产气肠杆菌和枯草芽孢杆菌均无相关作用（FIC＝1.5），对啤酒酵母和酿酒酵母表现出无相关作用（FIC＝2.0），对所有供试菌种均无拮抗作用。关于肉桂油与其他精油的联合抗菌活性已有报道，如Siddiqua等［17］报道了肉桂醛和丁香精油组合对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的协同抑制效果；许倩等［18］报道了肉桂和紫苏精油复配对冬枣常见致病菌青霉和黑曲霉的明显抑制效果；Nikkhah等［19］报道了肉桂和百里香精油联合使用具有协同抗菌效果（FIC＜0.5），且对梨腐败真菌的抑制效果好于2种精油单方使用，而关于肉桂与八角油的联合抗菌作用报道很少。

2.3 肉桂油和八角油最佳抑菌复配比例的选择

2.3.1 肉桂油和八角油不同比例复配精油的紫外波长扫描

肉桂和八角及其不同比例复配精油的紫外波长扫描结果见图1，最大吸收波长见表3。

图1 肉桂油和八角及其不同比例复配精油的紫外光谱扫描Fig.1 Ultraviolet spectrum scanning of cinnamon and star anise and their different proportions of essential oils

表3 肉桂和八角及其不同比例复配精油的紫外最大吸收波长Table3 UV absorption maximum wavelength of cinnamon and star anise and their different proportions of essential oils

由图1和表3可知，肉桂油和八角油单方的乙酸乙酯溶液紫外最大吸收分别在282.5，259.5nm，复配精油的最大吸收处于2种精油的单方吸收之间。还可以看出，肉桂油和八角油复配比例不同，最大吸收波长发生移动，说明不同比例精油复配后其化学组成发生变化，推断其抑菌活性也会发生改变，因此，对肉桂油和八角油最佳抑菌复配比例进行了选择。

2.3.2 肉桂油和八角油最佳抑菌复配比例的选择

根据前述联合抗菌作用研究结果，肉桂和八角复配精油对嗜水气单胞菌的抑制表现出协同作用，对恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的抑制表现出相加作用。因此，以此3种细菌为供试菌种，对2种精油的最佳抑菌复配比例进行了选择，结果见表4。

表4 肉桂油和八角油最佳抑菌复配比例的选择（抑菌圈直径：mm）Table4 Selection of the best combined antibacterial ratio of cinnamon oil and star anise oil（inhibition zone diameter：mm）

续 表

由表4可知，复配体积比例在4∶1～1∶1（肉桂油∶八角油）时，对3种菌种都表现出抑制效果，抑菌圈直径在18.29～13.25mm范围内变化，且对3个菌种的最佳抑菌复配比例均为3∶1（肉桂油∶八角油）。体积比例在1∶2～1∶4（肉桂油∶八角油）时，复配精油对供试菌种都没有表现出抑制效果，即没有抑菌圈。上述结果说明，在复配精油中肉桂油所占比例超过50.0%时，具有抑菌效果，而八角油所占比例超过66.7%时，复配精油对供试菌种没有抑制效果。由此可以推断，在复配精油中起主要抑菌作用的是肉桂油，少量八角油对肉桂油的抑菌活性起到协同或相加作用。这与前面2种精油单方使用时的抑菌结果相一致，即在同一试验条件下，浓度相同的肉桂油抑菌效果好于八角油，肉桂油对供试酵母菌和细菌的MIC分别为31.25，125.0mg／mL，而八角油对供试细菌和酵母菌的MIC均为1000.0mg／mL，分别是肉桂油 MIC的32倍（酵母菌）和8倍（细菌）。肉桂油的主要化学组成成分是肉桂醛，肉桂醛具有显著的抗菌效果［20］。八角油的主要化学组成成分是茴香脑，茴香脑的抑菌效果较弱［21，22］。

2.3.3 肉桂油和八角油单方和联合使用抑菌效果对照

对肉桂油和八角油单方及复配抑菌效果进行比较，结果见表5。

表5 肉桂油和八角油单方和联合使用抑菌效果对照Table5 Comparison of antibacterial effect of cinnamon oil and star anise oil alone and in combination

由表5可知，浓度为31.25mg／mL的肉桂油和浓度为125.0mg／mL的八角油按照3∶1复配后对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径大于浓度为250.0mg／mL的肉桂油和1000.0mg／mL的八角油单方使用时的抑菌圈直径；浓度为62.5mg／mL的肉桂油和浓度为125.0mg／mL的八角油按照3∶1复配后对恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的抑菌圈直径大于浓度为250.0mg／mL的肉桂油和1000.0mg／mL的八角油单方使用时的抑菌圈直径。上述结果表明，肉桂油和八角油复配后对供试菌种的抑制活性增强，并可以降低各自的使用浓度（剂量），用于果蔬保鲜，可以减弱对果蔬感官特性的负面影响。

3 结论

肉桂油对供试酵母和细菌的MIC分别为31.25，125.0mg／mL，八角油对供试酵母和细菌的MIC均为1000.0mg／mL，肉桂油单方使用时的抑菌效果好于相同浓度的八角油。肉桂油和八角油按1∶1体积比复配使用时，对嗜水气单胞菌的抑制表现出协同作用（FIC＝0.375），对恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌表现出相加作用（FIC＝0.625），对所有供试菌种均无拮抗作用。肉桂油和八角油复配比例变化，抑菌活性也会发生改变。混合精油中，当肉桂油所占体积比例超过50.0%时，对嗜水气单胞菌、恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌表现出抑制效果，且对3个菌种的最佳抑菌复配比例均为3∶1，八角油所占比例超过66.7%时，复配精油对供试3个菌种没有抑制效果。综上，肉桂油和八角油联合使用可以增强抑菌活性，降低各自的使用浓度（剂量），从而可以减弱用作保鲜剂时对果蔬感官特性的负面影响。