基于多元统计分析的不同产地红花椒挥发性成分差异分析

王思思，钟葵，史波林，汪厚银，张璐璐，刘龙云，赵镭＊

（1.西南交通大学 生命科学与工程学院，成都 610031；2.中国标准化研究院 食品与农业标准化研究所，北京 102200）

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）属芸香科花椒属落叶小乔木或灌木，在我国已有2000多年的栽培历史。作为一种食药两用经济作物，花椒在我国分布极广，在华东、华北、华中、西南、西北等地区均有栽培。受生态环境影响，不同产地花椒品质特征具有明显差异，这种差异导致其在应用价值、价格上差别较大［1－5］。

香气是花椒品质评价的重要指标之一，易受气候条件（日照时间、降水量、干燥度、气温等）以及土壤特性等的影响，因此不同产地花椒中挥发性物质的组成和含量存在差异。樊丹青等［6］采用气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对甘肃、四川等6个产地红花椒的挥发性成分进行了分析，结果表明不同产地红花椒中芳樟醇、乙酸芳樟酯等主要成分存在差异。陈光静等［7］也采用GC-MS对陕西、甘肃、四川3个省8个产地的红花椒挥发物进行了比较，发现21个共有成分在不同产地红花椒中存在较大的差异，非共有成分的含量均比较低。

为进一步扩大研究样本范围，并将物质构成分析与整体模式识别和数据挖掘相结合，更好地揭示我国红花椒主产区、产地红花椒的主要差异，本研究收集了我国西南、西北、华北、华东4大花椒主要产区16个不同产地红花椒样品。首先采用HeraclesⅠ快速气相电子鼻技术从样品挥发性组分整体模式特征上进行分类，再采用GC-MS结合非监督学习算法主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析对样品进行具体物质构成上的区分，同时运用偏最小二乘判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）进行变量重要性因子分析（variable importance for the projection，VIP），寻找区分不同产地花椒样品的重要贡献性物质，以期为花椒产地识别、定向应用等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

花椒样品均为大红袍花椒，其中四川花椒样品由成都珪一食品开发股份有限公司提供，其余样品均由陕西省韩城市花椒管理局提供，详细信息见表1。

表1 花椒样品产地信息Table1 The origin information of Zanthoxylum bungeanum

1.2 仪器及试剂

HeraclesⅠ快速气相电子鼻（配有Combi PLA自动进样器，瑞士CTC公司） 法国Alpha M.O.S公司；7890A-5975C气相色谱-质 谱 联 用 仪、2cm 50／30μm PDMS／DVB／CAR萃取头、C6～C16 正构烷烃标品 美国Agilent科技公司；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；40目标准检验筛 浙江省上虞市沙筛厂；AL 104-1C型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；手动SPME进样器 美国Supelco公司；PC-420D磁力加热搅拌器 美国Corning公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HeraclesⅠ测定条件

1.3.1.1 样品制备

依据GB／T 12729.2—2008《香辛料和调味品取样方法》进行取样［8］，去除花椒中叶、柄、籽、闭目椒及其他杂质，粉碎（约1min）过40目筛。准确称取0.20g花椒粉于20mL顶空瓶中，加盖密封待测，每个样品重复测定3次。

1.3.1.2 检测参数及程序

载气（H2），流速160mL／min；顶空时间600s，顶空温度60℃；进样量500μL，进样速率500μL／s，进样口温度250℃；捕集肼温度35℃，解吸温度250℃；柱温40℃，保持1s，以3℃／s升至250℃，保持30s；氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）温度280℃；采集时间100s。

将装有待测样品的顶空瓶放入样品托盘中，每3个平行后加1个空白样（空瓶），以消除对下一个样品的影响。

1.3.2 GC-MS测定条件

1.3.2.1 样品制备

花椒粉制备方法同上，准确称取50mg花椒粉于20mL顶空瓶中密封待测，每个样品平行测定3次。

1.3.2.2 检测参数及程序

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）条件：萃取温度60℃，顶空时间20min，萃取时间30min。

GC-MS条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25mm）；载气（He），载气流速1.5mL／min；进样口温度250℃；柱温65℃，以25℃／min升至90℃，保持1min，以1℃／min升至105℃，保持2min，以3℃／min升至200℃，保持2min，以30℃／min升至250℃，保持2min；分流比20∶1。

质谱参数：接口温度280℃；离子源温度230℃；电子电离源；电子能量70eV；质量扫描范围（m／z）35～500。

将吸附完成的SPME进样针迅速插入GC进样口，推出萃取头解吸附15min，同时启动GC进行数据采集。

1.4 数据统计

1.4.1 GC-MS定性定量

通过NIST 14.0数据库检索结合保留指数（retention index，RI）对GC-MS检测结果进行鉴定，采用峰面积归一法对目标化合物进行半定量分析。

1.4.2 统计分析

运用SPSS 19.0对HeraclesⅠ响应结果进行系统聚类分析，MetaboAnalyst绘制热图，SIMCA-P 11.5软件对GC-MS数据进行PCA和PLS-DA分析，GraphPad Prism 5.0绘图。

1.4.3 保留指数计算

式中：Ix为保留指数；n为碳数；tr′（x）为保留在碳数n和n＋1正构烷烃之间目标化合物的保留时间；tr′（n）为碳数为n的正构烷烃的保留时间；tr′（n＋1）为碳数为n＋1的正构烷烃的保留时间。

2 结果与分析

2.1 HeraclesⅠ响应特征分析

HeraclesⅠ快速气相电子鼻是结合传统气相色谱功能和电子鼻模式识别功能的分析仪器，由自动进样系统、检测系统（包括2根不同极性色谱柱和2个氢火焰检测器）和数据接收系统组成。集合了气相色谱高效分离和电子鼻快速识别的特点，常用于样品中挥发性组分的快速分析［9－11］。

采用HeraclesⅠ对样品进行分析，得到保留时间-相对含量分布图，见图1。

图1 红花椒保留时间-相对含量分布图Fig.1 Distribution map of retention time-relative content of Zanthoxylum bungeanum

图1中横坐标为保留时间，代表信号响应点；纵坐标为相对含量，代表响应强度。16个产地的红花椒样品共有56个响应点，色谱柱1上有27个响应点，色谱柱2上有29个响应点。其中高于平均相对含量1.78%的响应点共有14个（18.63-1，21.32-1，22.97-1，26.29-1，28.95-1，35.90-1，16.89-2，20.49-2，22.34-2，24.77-2，27.37-2，30.18-2，33.00-2，37.60-2），陕西、四川地区（Z4，Z11～Z16）有8个，河北地区（Z1）有9个，山西、山东、甘肃地区（Z2，Z3，Z5～Z10）有10个；高于10%的响应点共有6个（22.97-1，26.29-1，35.90-1，22.34-2，24.77-2，37.60-2），其中甘肃临夏积石山有2个响应点，山东莱芜莱城区有3个响应点，其他地区均有4个响应点。高于20%的响应点共有2个（22.97-1和24.77-2），陕西、青海、甘肃地区无高于20%的响应点，其他地区均有2个，见图1。

采用系统聚类对16个产地红花椒样品进行聚类分析，结果见图2。

图2 红花椒系统聚类分析图Fig.2 Hierarchical cluster analysis diagram of Zanthoxylum bungeanum

设定距离为10时，16个样品可聚为3类。其中陕西、甘肃、青海地区聚为一类（Z3～Z7），代表我国西北花椒产区；河北、山西、山东地区聚为一类（Z1，Z2，Z8～Z10），代表我国华北、华东花椒产区；四川地区单独聚为一类（Z11～Z16），代表我国西南花椒产区。三大类样品在双极色谱响应图上的差别主要表现在响应点35.90-1和37.60-2的响应强度上，西北地区样品在这2个响应点上的响应值均高于10%，而西南地区样品响应值在5%～10%之间，华北、华东地区样品响应值则低于5%，呈现为有明显差异的双极色谱响应雷达图，见图3。

图3 红花椒双极色谱响应雷达图Fig.3 Bipolar chromatographic response radar map of Zanthoxylum bungeanum

2.2 GC-MS定性定量分析

快速气相电子鼻的结果显示了在一类结构性质相似的物质构成上样品间存在差异，为进一步确定哪些物质构成及其含量存在差异，进一步采用GC-MS对16个产地红花椒挥发性组分进行了定性和定量分析。

通过NIST数据库检索（匹配度≥80%）对目标化合物进行了初步判定，再通过对比计算所得RI与文献中的RI对目标化合物进一步确定［12，13］，并采用面积归一化法进行半定量分析。运用MetaboAnalyst绘制不同产地样品GC-MS分析热图见图4。

图4 红花椒GC-MS测定结果热图Fig.4 Thermal map of GC-MS determination of Zanthoxylum bungeanum

热图中颜色由浅到深表示化合物含量依次增加。16个产地红花椒共鉴定出62个组分，主要为烯烃类（31种）、醇类（17种）、酯类（8种）以及少量其他醛、酮类（6种）化合物。其中主要挥发性物质有D-柠檬烯、芳樟醇、γ-萜品醇、乙酸芳樟酯、桧烯、β-月桂烯等，与陈光静等报道的红花椒中主要挥发性组分有月桂烯、柠檬烯、桉树醇、芳樟醇、γ-萜品醇以及刘飞等报道的芳樟醇、乙酸芳樟酯、α-松醇、γ-萜品醇、柠檬烯的研究结果基本一致。与Zhu、Yang等［14，15］报道的乙酸芳樟酯、芳樟醇、柠檬烯相比，本研究鉴定出的γ-萜品醇、桧烯、β-月桂烯等物质的相对含量较高，这可能与所采用的提取方法不同有关。热图聚类结果表明16个不同产地红花椒可以分为三类，其中陕西、甘肃、青海地区为一类（Z3～Z7）；河北、山西、山东地区为一类（Z1，Z2，Z8～Z10）；四川地区单独聚为一类（Z1～Z16），与上述Heracles聚类结果一致。

2.3 挥发性物质PCA及PLS-DA分析

PCA分析是利用降维思想，将原来的众多变量通过降维、除噪转化为几个综合指标用于反映原来变量的信息［16，17］。利用SIMCA-P对16个不同产地红花椒的GC-MS结果进行分析，绘制不同样品得分图，见图5。

图5 GC-MS结果PCA得分图Fig.5 PCA score plot of GC-MS results

由图5可知，华北、华东地区（Z1，Z2，Z8～Z10）、西北地区（Z3～Z7）、西南地区（Z11～Z16）仍然可以有效区分，与上述聚类分析结果一致。

由于PCA、聚类分析都是一种非监督的学习算法，即在不给定样品标签的情况下进行建模，侧重于描述样品分类趋势，不能消除组内噪音，不利于观察不同类别之间的差异来源［18，19］。因而进一步在PCA和聚类分析的基础上采用一种有监督的学习算法PLS-DA进行建模。首先依据聚类结果对样品预设分组，使用SIMCA-P软件建模，以消除组内噪音而突出组间的差异［20，21］，得分图见图6。

由图6可知，三大类不同产地红花椒得到有效区分，且聚类效果略好于PCA，表明PLS-DA模型可以有效消除组内噪音和背景噪音。基于PLS-DA模型，对不同组别样品中的差异物进行分析，绘制VIP棒状图，见图7。VIP值常用于评价PLS-DA模型中变量的重要程度，即变量在不同类别样品区分中的重要程度，值越大表明该变量越重要，通常认为VIP＝1.5的变量对样品区分有相对较大的贡献［22－24］。

图6 GC-MS结果PLS-DA得分图Fig.6 PLS-DA score plot of GC-MS results

图7 PLS-DA模型的VIP图Fig.7 VIP plot of PLS-DA model

由图7可知，16个红花椒样品区分贡献最大的物质为γ-萜品烯，其VIP值为1.506，其次为大根香叶烯（VIP＝1.415）、α-依兰油烯（VIP＝1.399）、α-松油烯（VIP＝1.392）、反式-2-蒈烯-4-醇（VIP＝1.351）、β-合金欢烯（VIP＝1.331）等。VIP得分说明γ-萜品烯、大根香叶烯、α-依兰油烯、α-松油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金欢烯是区分华北、华东地区、西南地区、西北地区这三类红花椒主要产区产地样品的特征性挥发性成分。

对不同地区样品中这6种物质的相对含量进行分析，结果见图8。

图8 VIP得分较高的6种物质含量分布图Fig.8 Distribution map of six substances with higher VIP score

由图8可知，第一类地区（华北、华东）红花椒中γ-萜品烯、α-松油烯含量均高于其他两类地区，α-依兰油烯含量与第三类地区（西南）水平相当且高于第二类地区（西北），大根香叶烯和β-合金欢烯含量低于第三类地区而高于第二类地区；第二类地区γ-萜品烯、大根香叶烯、α-松油烯、α-依兰油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金欢烯含量均低于第一类地区，γ-萜品烯、α-松油烯含量高于第三类地区；第三类地区大根香叶烯、β-合金欢烯含量高于其他两类地区。整体而言，华北、华东地区红花椒中大根香叶烯、γ-萜品烯、α-依兰油烯、α-松油烯、β-合金欢烯、反式-2-蒈烯-4-醇6种物质含量高，而西北地区含量高的物质为γ-萜品烯和α-松油烯，西南地区花椒中大根香叶烯、α-依兰油烯、β-合金欢烯、反式-2-蒈烯-4-醇含量高。

花椒挥发性组分相对含量的不同赋予其特有的香气特征。6种特征物中，γ-萜品烯具有松木香、甜柑橘香等香气特征，大根香叶烯具有青香、木香，α-松油烯具有柠檬似香气，β-合金欢烯具有花香、木香、青香、膏香等香气特征［25，26］。华北、华东地区中 γ-萜品烯、α-松油烯、β-合金欢烯、大根香叶烯含量较高，表现为偏柑橘香、柠檬香、木香、花香、青香等综合香气特征。西北地区中γ-萜品烯、α-松油烯含量相对较高，说明其香气偏柑橘香、柠檬香。西南地区中大根香叶烯、β-合金欢烯含量相对较高，说明其香气偏木香、花香、青香等香气特征。

3 结论

本研究以我国4个花椒主要产区的16个花椒主要产地的红花椒作为研究对象，首先采用快速气相电子鼻对16个产地的红花椒挥发性组分指纹信息进行分析，以探讨挥发性组分与产地的相关性。在此基础上采用GC-MS技术对不同产地花椒样品的挥发性组分进行鉴定以分析不同产地样品挥发性组分的差异。通过多元统计分析发现我国不同产地红花椒样品可以分为三类，其中以四川为代表的西南地区为一类，以陕西、青海、甘肃为代表的西北地区一类，以河北、山西、山东为代表的华北、华东地区为一类，这与我国地理分区基本吻合，表明生态环境对红花椒的香气品质有显著影响。

在对产地进行区分后，对PLS-DA模型的VIP值进一步展开分析以探讨不同地区样品挥发性物质特征差异。结果表明：γ-萜品烯、大根香叶烯、α-松油烯、α-依兰油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金欢烯可以区分不同产区红花椒样品，是样品间香气差异来源。西南地区红花椒中大根香叶烯、α-依兰油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金欢烯含量高，西北地区红花椒中γ-萜品烯、α-松油烯含量高，华北、华东地区红花椒中γ-萜品烯、大根香叶烯、α-松油烯、α-依兰油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金欢烯含量高。通过对6种物质中4种具有香气特征物质进行分析，发现华北、华东地区花椒偏柑橘香、柠檬香、木香、花香、青香；西北地区花椒偏柑橘香、柠檬香；西南地区花椒偏木香、花香、青香等。