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半夏泻心汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能保护作用及ZO-1和Occludin表达的影响❋

2019-03-18毛艺纯周淑芬

中国中医基础医学杂志 2019年1期
关键词:泻心汤溃疡性结肠炎

徐 凤,毛艺纯,周淑芬,商 华

(牡丹江医学院第二附属医院,黑龙江 牡丹江 157011)

溃疡性结肠炎(UC)是一种原因不明的慢性自身免疫性肠炎,具有易复发、易引起并发症的特点[1]。研究学者认为,本病的发病基础是当肠道黏膜屏障功能减弱时,肠道致病菌和毒素更加容易通过肠道黏膜引发局部免疫反应[2-4]。研究发现,黏膜屏障在溃疡性结肠炎发病过程中发挥了极其重要的作用[5],因此保护肠道黏膜屏障对治疗溃疡性结肠炎至关重要[6]。近年来,中医在溃疡性结肠炎防治方面显现出较大优势。半夏泻心汤方出自张仲景的《伤寒论》,由半夏、干姜、黄连、黄芩、大枣、人参、甘草组成,具有补泻兼施、辛开苦降、调畅气机、寒温并用的配伍特点,可治疗气机阻滞、脾胃同病,因而被广泛应用于胃炎、胃溃疡、慢性溃疡性结肠炎等疾病的治疗[7-9]。有关对溃疡性结肠炎的治疗作用,大多文献着重于其临床观察[9],而对于机制研究如对肠道黏膜屏障的保护作用鲜见报道。故本研究观察了半夏泻心汤对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型黏膜屏障功能的保护作用以及紧密连接相关蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和闭锁蛋白(Occludin)表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级健康BALB/c小鼠70只,体质量(25±2)g,购于哈尔滨医科大学实验动物学中心(实验动物合格证号SCXK(黑)2015-001,实验动物使用许可证号SYXK(黑)2015-007)。

1.2 实验药物

半夏泻心汤组成:半夏12 g,干姜9 g,黄芩9 g,人参9 g,甘草9 g,黄连3 g,大枣12 g。精确称取上述药物浸泡30 min(人参提前浸泡24 h),煎煮2次,每次30 min,4层纱布过滤,合并滤液水浴蒸发制成1 g/mL生药的水煎液,高温灭菌,冰箱4 ℃保存待用。

1.3 主要试剂

TNBS(美国Sigma公司,货号P2297);柳氮磺吡啶肠溶片(SASP,上海福达制药有限公司,国药准字:H31020840);ZO-1和Occludin一抗(英国abcam公司,货号分别为xy00046,YH-02495 m);山羊抗小鼠荧光二抗(美国Abbkine公司,货号分别为A23227,A23210)。

2 方法

2.1 溃疡性结肠炎小鼠模型建立

小鼠按随机数字表法分为正常对照组12只,模型组58只。模型组小鼠禁食不禁水24 h后麻醉(10%水合氯醛腹腔麻醉,0.25 mL/100 g),以改良的小鼠灌胃针一次性将TNBS(70 mg/kg)溶液轻缓注入小鼠肠腔内,提尾倒立1 min待自然清醒。正常对照组按照同样方法以同等剂量的生理盐水代替TNBS灌肠。

2.2 分组与给药

模型建立3 d后随机处死10只小鼠取结肠,如若观察到明显的溃疡面说明模型建立成功。将模型建立成功的小鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、半夏鸡心汤4.5 g/kg组、半夏鸡心汤9.0 g/kg组和阳性对照组,模型组给予生理盐水灌胃,参照文献[10]进行剂量换算及预实验结果,半夏泻心汤4.5 g/kg组给予4.5 g/kg半夏泻心汤水煎液灌胃,半夏泻心汤9.0 g/kg组给予9.0 g/kg半夏泻心汤水煎液灌胃,阳性对照组给予0.5 g/kg SASP灌胃,每组各12只。正常对照组以同等剂量的生理盐水代替半夏泻心汤灌胃。各组于造模后第3天开始灌胃,每日1次,连续21 d。

2.3 病变活动指数(DAI)评分[11]

DAI评分标准:体质量下降<1%计0分;体质量下降1%~5%计1分;体质量下降6%~10%计2分;体质量下降10%~15%计3分;体质量下降>15%计4分。大便性状:成形大便计0分;不黏附于肛门的糊状、半成形大便计2分;可黏附于肛门的稀水样便计3分;血便计4分。大便隐血:正常计0分;隐血阳性计2分;肉眼血便计4分。DAI=(体质量下降评分+大便性状评分+大便隐血评分)/3。

2.4 血清及标本采集

末次给药后禁食不禁水24 h,每组分别取6只小鼠麻醉(10%水合氯醛腹腔麻醉,0.25 mL/100 g),腹主动脉采血,3000 r/min离心10 min取上清,冰箱-20 ℃保存、待测。采血后处死小鼠,取出结肠段量取结肠长度。

2.5 结肠黏膜损伤指数(CMDI)[11]

CMDI评分标准:无损伤计0分;局部充血、水肿但未出现溃疡计1分;充血且肠壁变厚但无溃疡计2分;有溃疡仅有1处出现炎症计3分;溃疡较大,直径约1~2 cm,但肠管与外周脏器无黏连计4分;有多处溃疡和炎症,至少有1处溃疡大小>1 cm,与周围脏器黏连严重计5分。

2.6 结肠组织病理学评分(HS)[6]

结肠组织经多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,HE染色,镜下观察结肠黏膜形态学变化进行HS。HS包括炎症、炎症范围(%)、隐窝损伤、损伤深度。各项具体评分标准:炎症:无计0分;轻度计1分;中度计2分;重度计3分;炎症范围(%):1%~25%计1分;26%~50%计2分;51%~75%计3分;76%~100%计4分。隐窝损伤:无计0分;基底部1/3隐窝破坏计1分;基底部2/3隐窝破坏计2分;仅表面上皮完整计3分;全部隐窝和上皮破坏计4分。损伤深度:黏膜层计2分;黏膜及黏膜下层计3分;全层计4分。HS=炎症评分+炎症范围(%)评分+隐窝损伤评分+损伤深度评分。

2.7 髓过氧化物酶(MPO)活性测定

称取结肠组织50 mg,采用0.5%HTBA 溶液制成5%的匀浆,4 ℃以14000 r/min离心15 min取上清,严格按照MPO试剂盒操作说明书检测MPO活性。

2.8 血清二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸(D-LA)水平测定

严格按照ELISA试剂盒操作说明书检测血清DAO和D-LA的水平。

2.9 黏膜通透性评价

末次给药后禁食不禁水24 h,各组分别取6只小鼠放置代谢笼中。口服乳果糖(L)和甘露醇(M)混合溶液2 mL,并进行30 min内禁水、2 h内禁食。收集24 h内尿液,3000 r/min离心10 min,取10 mL尿液加入2 mL 0.2 g/L硫柳汞防腐后-70 ℃冻存。高压液相色谱试差法测定尿液中L和M含量,计算L/M值。

2.10 Western blot分析检测ZO-1和Occludin的表达

结肠组织匀浆后加入适量RIPA裂解液,10000 r/min 4 ℃离心10 min,取上清液BCA法测定总蛋白浓度。取30 μg蛋白上样后进行10% SDS-PAGE凝胶电泳。当电泳完成后,半干转将蛋白从凝胶上转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭。一抗孵育过夜,PBST冲洗后二抗孵育,ECL 发光试剂发光,胶片曝光、显影定影。扫描图像,凝胶图像分析软件分析条带积分值。

2.11 统计学方法

3 结果

3.1 半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型小鼠DAI评分的影响

表1显示,在实验过程中,正常对照组小鼠未见稀便和血便,精神佳,活动正常,毛发较为光泽,食欲好,体质量增加较快。模型组小鼠明显可见稀便和血便,精神萎靡不振,活动减少,饮食饮水明显减少,体质量下降;半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g /kg组和阳性对照组小鼠早期虽然可见稀便和血便、体质量下降、食欲差等症状,但是症状程度不及模型组严重,后期可见稀便和血便逐渐缓解,饮食逐渐好转,体质量逐步增加。与正常对照组比较,模型组小鼠DAI评分显著增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组小鼠在给药7 d后DAI评分显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表1 各组小鼠DAI评分测定结果(分,

注:与正常对照组比较:﹡P<0.05,﹡﹡P<0.01;与模型组比较:﹟P<0.05,﹟﹟P<0.01

3.2 半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠长度和CMDI的影响

图1表2显示,正常对照组小鼠可见结肠呈粉红色,均匀细长,色泽较为一致;模型组小鼠可见结肠充血且增厚,出现明显的溃疡,黏膜呈黑褐色并有表面坏死;半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组小鼠结肠明显恢复,充血减轻,仅见散在小溃疡,颜色趋于粉红色,坏死减轻。与正常对照组比较,模型组显著缩短小鼠结肠长度,显著升高CMDI,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组显著延长小鼠结肠长度,显著降低CMDI,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表2 各组小鼠结肠长度、CMDI和HS测定结果

注:与正常对照组比较:﹡P<0.05,﹡﹡P<0.01;与模型组比较:﹟P<0.05,﹟﹟P<0.01

图1 各组小鼠结肠组织大体外观比较

3.3 半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型小鼠HS的影响

图2表2HE染色结果显示,正常对照组小鼠结肠未见溃疡及坏死,黏膜上皮完整;模型组小鼠结肠黏膜及黏膜下层大量炎细胞浸润,上皮坏死脱落;半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组小鼠结肠黏膜及黏膜下层少见炎细胞浸润。与正常对照组比较,模型组小鼠HS显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组HS显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

3.4 半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织中MPO活性、血清DAO和D-LA水平、黏膜通透性的影响

表3显示,与正常对照组比较,模型组小鼠结肠组织中MPO活性、血清DAO和D-LA水平、尿中L/M值显著增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组小鼠结肠组织中MPO活性、血清DAO和D-LA水平、尿中L/M值显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

A.正常对照组;B.模型组;C.半夏泻心汤4.5 g/kg组;D.半夏泻心汤9.0 g/kg组;E.阳性对照组图2 各组小鼠结肠组织HE染色结果比较(HE染色 200×)

组别鼠数MPO活性(U/mg)DAO(U/mL)D-LA(μg/mL)L/M值正常对照组60.17±0.0042.63±0.1941.0779±0.04816.30±1.71模型组62.49±0.283﹡﹡4.51±0.317﹡﹡1.564±0.110﹡﹡42.21±5.32﹡﹡半夏泻心汤4.5 g/kg组61.31±0.124﹟3.32±0.221﹟1.234±0.059﹟25.66±2.94﹟半夏泻心汤9.0 g/kg组61.22±0.105﹟﹟2.96±0.209﹟﹟1.209±0.055﹟﹟22.84±2.70﹟﹟阳性对照组61.08±0.093﹟﹟2.85±0.203﹟﹟1.149±0.053﹟﹟20.32±2.61﹟﹟

注:与正常对照组比较:﹡P<0.05,﹡﹡P<0.01;与模型组比较:﹟P<0.05,﹟﹟P<0.01

3.5 半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型小鼠ZO-1和Occludin表达的影响

图3表4显示,与正常对照组比较,模型组小鼠结肠ZO-1和 Occludin表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,半夏泻心汤4.5 g/kg组、半夏泻心汤9.0 g/kg组和阳性对照组小鼠结肠ZO-1和Occludin表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

注:A.正常对照组;B.模型组;C.半夏泻心汤4.5 g/kg组;D.半夏泻心汤9.0 g/kg组;E.阳性对照组图3 Western bolt分析结果

组别相对表达水平ZO-1Occludin正常对照组1.087±0.1451.024±0.139模型组0.173±0.023﹡﹡0.076±0.010﹡﹡半夏泻心汤4.5 g/kg组0.463±0.067﹟0.408±0.062﹟﹟半夏泻心汤9.0 g/kg组0.714±0.109﹟﹟0.502±0.075﹟﹟阳性对照组0.929±0.140﹟﹟0.586±0.093﹟﹟

注:与正常对照组比较:﹡P<0.05,﹡﹡P<0.01;与模型组比较:﹟P<0.05,﹟﹟P<0.01

4 讨论

研究发现,溃疡性结肠炎发病的始动因素之一可能是由于肠道黏膜屏障的功能受损[12]。若肠道黏膜屏障的功能异常,则会引起肠道内的抗原物质移位至肠黏膜固有层,进而促进肠道释放促炎因子,破坏肠道上皮细胞,最终导致肠道黏膜屏障功能受损[13]。因此可以认为,假使采用有效的手段使肠道黏膜屏障功能增强,则会对溃疡性结肠炎的治疗产生积极意义。本次实验研究表明,给予半夏泻心汤治疗的溃疡性结肠炎模型小鼠DAI评分,CMDI和HS结肠长度有所延长,提示半夏泻心汤可能对溃疡性结肠炎具有积极作用。

中性粒细胞中含MPO酶较高,因此MPO活性的高低可以间接评价中性粒细胞浸润的数量及程度。DAO可评价肠黏膜屏障功能的状态,因其是存在于肠道黏膜上皮细胞中的细胞内酶,如果有肠道黏膜上皮损伤,就会使DAO从破裂的上皮细胞溢出进而进入血液,因此DAO升高能够间接反映肠道黏膜上皮细胞的损伤程度[14]。D-LA是细菌发酵的代谢产物,D-LA升高是由于其通过受损黏膜入血,故此可用于评价肠道黏膜损害程度[15]。本次实验研究表明,给予半夏泻心汤治疗的溃疡性结肠炎模型小鼠MPO活性降低,DAO和D-LA水平降低,提示半夏泻心汤可能对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道黏膜屏障功能具有良好的保护作用。

肠道上皮细胞旁路通透性异常升高是溃疡性结肠炎的特征之一,也是导致炎症反应的主要因素,主要是因其通透性升高对肠道内的致病菌和毒素的屏蔽作用减弱,从而使致病菌和毒素通过并进入上皮下层。为准确反映肠道黏膜的通透性变化,可以采用测定尿中L/M值的变化,如若L/M值增高,代表肠道通透性升高,说明肠道黏膜屏障功能受到破坏[16]。本次实验研究表明,给予半夏泻心汤治疗的溃疡性结肠炎模型小鼠L/M值降低。进一步提示半夏泻心汤可能对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道黏膜屏障功能具有良好的保护作用。

半夏泻心汤是如何发挥对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道黏膜屏障功能的保护作用,为探讨可能机制,本次实验对ZO-1和Occludin蛋白进行了检测。紧密型连接(TJs)为细胞间紧密连接3种连接中的1种,为细胞与细胞之间最重要的连接方式,构成上皮屏障功能的重要结构,对肠道黏膜通透性起决定性作用[17]。紧密连接蛋白在肠道黏膜屏障功能的维持中起决定性作用,是维持肠道黏膜屏障结构完整性的重要组成部分[18]。周膜蛋白紧密连接蛋白(ZO)家族,Occludin和Claudin跨膜蛋白家族是构成TJs的3种主要超家族蛋白[19]。

Occludin蛋白对TJs功能的维持起到重要的作用,是第一个被发现的定位于TJs的跨膜蛋白,包括1个短的细胞内环和2个长的细胞外环,其细胞内环部分与ZO家族相连,而细胞外环部分与相邻细胞的跨膜连接蛋白相互作用,封闭细胞间隙[17]。ZO有3种异构体,即ZO-1,ZO-2和ZO-3,其中ZO-1与其同源体ZO-2、ZO-3一起为紧密连接蛋白搭建具有连接作用的脚手架样平台,在TJs中起核心连接作用[20]。本次实验研究表明,给予半夏泻心汤治疗的溃疡性结肠炎模型小鼠ZO-1和Occludin表达水平显著升高,提示半夏泻心汤可能通过升高ZO-1和Occludin表达,从而保护溃疡性结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能。

综上所述,半夏泻心汤可能通过升高ZO-1和Occludin表达,从而保护溃疡性结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能。本研究的局限之处在于并未探讨拆方的作用。至于其拆方对溃疡性结肠炎小鼠的保护作用及可能机制,本研究将作进一步的探讨。

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