间充质干细胞在心肌梗死中归巢的优化策略

心肌梗死是心肌的缺血缺氧性坏死，往往导致心脏结构、功能、力学性质的永久性改变。由于治疗方法的不断进步，心肌梗死患者的预后得到明显改善。基于间充质干细胞(MSC)的细胞疗法在基础研究和临床应用方面有了长足发展。MSC是来源于中胚层的具有自我复制和多向分化潜能的多能干细胞，具有免疫调节特性[1-2]，能加速血管新生，促进心肌再生。移植后的MSC可向心肌梗死区自动归巢。然而研究表明，只有大约3%的MSC在移植24 h后出现在梗死边缘区，<1%的MSC能存活1周以上[3]。低归巢率与低存活率严重影响了MSC对梗死心肌的修复作用，因此，有必要提高MSC向靶组织特异性归巢的效率。

1 MSC的治疗作用

1999年，Makino等[4]首次利用5-氮胞苷体外诱导骨髓基质细胞分化为心肌细胞，探讨干细胞在心肌修复中的作用。2004年，Chen等[5]报道MSC移植可使急性心肌梗死患者左室射血分数增加12%。在梗死心肌的功能重建方面，干细胞的旁分泌机制发挥了重要作用[6]。MSC通过表达多种趋化因子、生长因子和黏附分子，调节相关信号转导通路，激发梗死区的内源性修复。MSC对心肌梗死的治疗作用包括:(1)免疫调节和抗炎；(2)抗纤维化；(3)促进血管形成；(4)抗心肌细胞凋亡；(5)促进心肌再生[7]。

MSC的安全性及有效性在动物模型与临床试验中均得到证实。因低表达CD40、CD80、CD86以及主要组织相容性复合体Ⅰ类分子，MSC在体内具有免疫耐受性[7]。Guo等[8]在心肌梗死小鼠中发现，MSC重复植入对心肌梗死的疗效优于单次植入，进一步证明了MSC的治疗作用。一项研究表明，接受MSC移植的患者在移植3个月后心肌瘢痕减少，1年后心室收缩末期容积减小24%[9]。Rodrigo等[10]经过5年随访，发现自体MSC心肌内注射治疗心肌梗死是可行和安全的。目前，MSC治疗心肌梗死已进入Ⅲ期临床试验。

2 MSC归巢的机制

归巢是干细胞疗法的初始环节，通常指MSC在体内外因素的作用下定向迁移，越过毛细血管壁至靶组织并定植存活的过程。MSC向心肌的归巢受多种趋化因子、生长因子、黏附分子的调节，其中起关键性作用的是基质衍生因子-1(SDF-1)和趋化因子受体4(CXCR4)[11]。梗死心肌中SDF-1表达上调并向周围扩散，MSC借助其质膜受体CXCR4沿SDF-1浓度梯度迁移至受损组织。黏附于毛细血管壁的MSC跨内皮细胞层进入靶组织，并通过细胞黏附分子及其配体归巢至特定靶点[12]。在归巢过程中，炎性因子白细胞介素-1β促进基质金属蛋白酶-1的表达，进而激活蛋白酶激活受体-1和G蛋白偶联的信号通路，溶解细胞外基质，促进MSC迁移[13]。

目前，MSC归巢、分化的具体机制尚未完全阐明，不同来源的MSC显示出不同的归巢分子表达谱[2]，这进一步增加了研究的难度。

3 提高MSC归巢效率的策略

细胞疗法的疗效与移植细胞在靶组织的有效归巢和准确植入密切相关。通过预处理MSC、修饰靶组织、优化移植方式，可从多方面提高MSC的归巢效率。

3.1 MSC预处理

3.1.1 改善扩增模式 各组织来源的MSC在植入心肌前都需要进行体外扩增，以获得足量的细胞进行治疗。然而，常规的二维培养方式易导致细胞表型的改变，如趋化因子标志物的丢失，从而降低细胞的归巢迁移能力。三维细胞培养是介于二维细胞培养与动物实验之间的一种技术，能最大程度地模拟体内环境。有研究表明，CXCR4在球状脂肪源性MSC中的表达水平是常规培养的2倍[14]。Joshi等[15]利用2 mg/mL胶原蛋白和10 μmol/L 5-氮杂胞苷构建三维微环境，对MSC进行扩增，细胞移植后的MSC归巢率显著提高。

3.1.2 细胞表面工程 在细胞表面引入官能团或生物活性物质可提高MSC的归巢率，常用的引入方式有共价连接、疏水性相互作用、静电相互作用等。Kean等[16]利用噬菌体展示技术在心肌梗死小鼠模型中鉴定CRPPR、 CRKDKC、KSTRKS、CARSKNKDC等4个具备心肌梗死靶向性的肽序列。在将该肽序列修饰的MSC注入心肌梗死小鼠模型后，小鼠心脏的MSC检出率升高。由于心肌梗死后SDF-1高表达时段较短，而细胞因子共培养、病毒转染以及常规的促CXCR4表达技术耗时较长，这些手段对于急性心肌梗死治疗缺乏应用价值。Won等[17]创新性地借助聚乙二醇将CXCR4分子结合于MSC细胞膜，全程仅耗时10 min，为改善MSC归巢提供了一种临床可行的方法。

3.1.3 基因修饰 MSC在体外分离、扩增的过程中易丢失趋化因子受体和黏附分子(如CXCR4)，借助病毒或非病毒载体对细胞进行转染可实现相关分子的再表达。且通过基因修饰，MSC能够针对特定配体表达目标受体，进一步提高了MSC的归巢率。有研究将MSC用CXCR4过表达载体反向转染后应用于心肌梗死大鼠模型，结果显示转染组的归巢细胞数量是未转染组的3倍[18]。但病毒转染法在临床应用时存在潜在的致癌性、致病性和免疫原性风险，非病毒转染法转染效率又偏低。Mun等[19]以微环(minicircle)作为基因表达载体，创新性地采用微孔法(microporation)转染MSC，使转染效率提高了66%。该研究发现，CXCR4的过表达明显增强了MSC向受损心肌的归巢能力。

3.1.4 组织工程 MSC在归巢过程中易受到缺血缺氧、炎性细胞攻击、血流冲击等不利因素影响而失巢或凋亡，组织工程可构建特异性支架、补片或合成仿生细胞外基质，促进细胞的高活性注射、迁移和准确归巢。如带有高亲和力趋化因子和黏附分子的生物支架，可以弥补细胞在分离、扩增过程中丢失的富含各种细胞因子的细胞外基质[20]。在仿生基质的构建上，Saxena等[21]研究了MSC在不同刚度基质上的趋化作用，结果表明MSC在软基质上具有更高的归巢率。此外，He等[22]开发了一种对活性氧(ROS)敏感的含SDF-1α的纳米颗粒，该纳米颗粒能对组织病变中高浓度的ROS进行降解，达到靶向释放SDF-1α的目的，从而促进MSC归巢。

3.1.5 细胞因子/药物共培养 在培养基中加入药物或细胞因子可诱导细胞重要归巢分子的表达上调，调节相关信号通路。白细胞介素-3已被证明能够调节CXCR4/SDF-1α轴，进而促进MSC迁移[23]。Popa等[24]采用30 nmol/L二氢睾酮对MSC进行预处理，体外研究发现MSC向心肌切片的迁移速度增加了2倍，且整合率明显高于对照组。另外，胰岛素样生长因子1、肿瘤坏死因子-α、γ-干扰素等也被证实可提高MSC归巢率[25]。

3.1.6 物理环境预适应 让细胞提前适应即将面临的环境变化，有助于提高移植细胞的存活率与植入率。(1)缺氧预处理：心肌梗死边缘区是MSC临床治疗常用的注入靶点，其氧分压通常不超过1%[26]。Heirani-Tabasi等[27]采用丙戊酸、氯化钴等化合物模拟缺氧环境对MSC进行预处理，结果发现MSC在缺氧环境下过表达CXCR4，进而明显促进了MSC迁移。CXCR4的表达受缺氧诱导因子-1α的调节[28]，这可能是CXCR4在缺氧环境中表达上调的合理解释。此外，Hu等[29]在心肌梗死猴子模型中进行的研究提示，0.5%低氧培养的MSC的迁移能力增强，凋亡数目减少。(2)酸性环境预处理：CXCR4对MSC迁移、归巢和分化的调节在心肌再生中发挥关键作用。Cencioni等[30]研究发现，酸性预处理能够增加干细胞中CXCR4的表达，进而增强细胞的治疗潜力，有利于梗死心肌的修复。(3)自体血清预处理：MSC虽无免疫原性，但在体外培养过程中受异种血清的影响，移植后宿主可能会出现急性排斥反应。Haque等[31]提出了两阶段的细胞体外培养策略。第一阶段，MSC在常规培养基中分离和扩增；第二阶段，扩增后的MSC在自体血清中培养，进行移植前的适应。这种短暂的适应有助于细胞趋化因子受体的表达和组织特异性分化，从而提高细胞的归巢率和存活率。

3.1.7 磁性靶向技术 磁性靶向技术是一种促进MSC归巢的新型辅助策略。将MSC与磁性纳米颗粒共培养可使其磁化，磁化的MSC可借助特定的磁场在体内靶向移动，从而使分散的MSC高效地集中于靶组织并维持一定的滞留率。Huang等[32]的研究表明，借助磁性靶向技术，MSC经冠状动脉注射24 h后，心脏的细胞滞留率增加了2.73～2.87倍。

3.2 靶组织修饰

3.2.1 辐射预处理 低水平激光照射是干细胞靶向归巢的有效策略，有助于梗死心肌募集MSC。辐射预处理的效果受激光的波长、功率密度、持续时间、能量密度、传输时间、照射类型等参数的影响。El Gammal等[33]发现，在心肌梗死4 h内利用804 nm波长和1 J/cm2能量密度的低水平激光处理梗死心肌能达到较好的治疗效果，主要体现在干细胞存活率与归巢率的提高及心肌梗死面积的减小。

3.2.2 超声波的应用 超声波方向性好，穿透能力强，近年来也被用于促进干细胞归巢。超声靶向微泡破坏技术(UTMD)可使毛细血管壁形成孔隙，从而提高其通透性，有助于MSC从血管迁移至梗死心肌，但具体机制尚不清楚[34]。Li等[35]进行的体内外实验表明，UTMD不仅促进SDF-1的分泌，而且使表达CXCR4的MSC比例增加。Chang等[36]在心肌梗死犬模型上通过对照试验证明了UTMD联合冠状动脉内移植能够提高MSC归巢至梗死区的准确性与有效性。

3.2.3 靶组织基因修饰 在MSC移植前对靶组织进行基因修饰，有望增加归巢相关分子的表达。Su等[37]将携带SDF-1α基因的腺病毒装载在微泡载体上，利用UTMD将腺病毒转染至梗死大鼠心肌，转染后大鼠外周血中SDF-1α水平明显升高。进一步分析发现，MSC向心肌的归巢数量增加，说明干细胞的归巢数量受SDF-1α表达水平的调控。

3.2.4 其他 SDF-1α对缺血心肌具有多向性作用，既可梯度引导MSC归巢至心肌损伤靶点，又能通过细胞内信号转导通路直接保护心肌。心肌梗死后SDF-1α表达上调，但其在血浆中的半衰期相对较短，仅为(25.8±4.6) min[38]。二肽酰肽酶4(DPP-4)抑制剂可减少DPP-4对SDF-1α的降解，将SDF-1α维持在较高的水平[39]。MSC移植前,在心肌靶点人工注入趋化因子SDF-1α，有可能提高MSC的归巢率。此外，化疗、放疗以及电场在靶组织修饰中的作用也得到了深入研究。

3.3 MSC移植方式

3.3.1 注射途径 在临床应用中，可采用不同的注射方式植入MSC，如动/静脉注射、冠状动脉注射、心肌内注射。其中静脉注射因具有创伤小、可重复的特点，应用最广泛，但细胞易迁移到梗死心肌以外的区域而导致MSC失巢凋亡或微血栓形成。研究表明，经静脉注射的MSC主要滞留于肺部，可能是由于体外扩增使细胞体积增加。在注射MSC前给予血管扩张剂，滞留于肺部的MSC数量明显减少，归巢率增加[40]。此外，在应用纳米生物材料注射系统时，直径在10～100 nm的纳米颗粒能够有效改善循环时间[41]。

3.3.2 最佳剂量与注射时间 MSC在临床应用中的最佳移植时间和最佳剂量仍不明确。近期的一项荟萃分析表明，对于行经皮冠状动脉介入术(PCI)的急性心肌梗死患者，术后1周内注射不超过1×107个MSC可能是改善左室收缩功能的最佳策略[42]。另外，有研究发现，在急性心肌梗死后1周进行MSC移植，细胞存活率与归巢率最高。过迟移植会导致细胞滞留于心脏以外的组织而失巢凋亡，过早移植则易出现植入不良，因为在急性心肌梗死急性期，心肌存在明显的炎性反应[43]。

SDF-1α/CXCR4信号通路在引导MSC定向迁移中至关重要。但梗死心肌表达的SDF-1α半衰期较短，心肌梗死后注射MSC可能错过心肌表达SDF-1α的高峰期，从而使归巢率降低。通过调控趋化信号的表达来优化干细胞归巢和植入，有可能成为MSC治疗的关键。

4 挑战与展望

MSC对心肌梗死的治疗作用已经得到证实，优化归巢策略有助于在不增加MSC注射数量的情况下提高疗效。但由于生理微环境的易变性以及个体的差异性，准确归巢的细胞比例仍然偏低。此外，MSC的临床应用缺乏统一的、标准的操作流程，且具体的归巢机制仍不明确，这就限制了干细胞疗法的进一步发展。我们总结了提高MSC归巢的策略，但其中许多方法尚未在临床试验中得到证实，故最优的治疗策略仍然有待探索。

建立合理的个体化干细胞治疗策略有助于最大限度地减少个体差异对疗效的影响，进而更易于评估MSC的临床疗效。此外，建立特定的疾病模型对患者个体化的特征(如血管几何形状、血流特性、梗死区的位置)进行参数分析，可从给药途径、注射部位、输注速度等方面确定最佳的临床治疗条件。未来的研究应着眼于更精准的靶向治疗，探索更标准的操作流程，开展更广泛的临床试验，以实现个体化靶向治疗的目标。