高通量测序技术及其在呼吸道感染领域的应用

陈晨 谭焰

南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)呼吸与危重症医学科210000

第一代测序技术以Sanger双脱氧核苷酸链终止法为代表，并借此完成了第一个人类基因组图谱的绘制，极大地拓展了医学研究的广度和深度。但由于该法通量低且耗时耗力，随着大数据信息化大时代的到来，第二代测序技术[高通量测序技术(high-throughput sequencing，nextgeneration sequencing，NGS)]应运而生。NGS的基本原理即所谓的“边合成边测序”，将DNA片段化从而建立DNA文库进行多克隆PCR，对每一步引物杂交及酶延伸反应产生的信号进行检测。无论是面对目前已知或未知的病原体，甚至是对宏基因组学这个我们尚未完全了解的神秘的领域，利用NGS都能精确、快速获得大量数据以供研究，独特优势使其越来越多地被引入到临床疾病分子诊疗之中。为提高对该技术的认识，现对其在呼吸道感染领域的应用进行简要介绍。

1 NGS在呼吸道病毒感染中的应用

NGS技术不仅提高了临床检测病毒的能力，同时可全面了解感染病原体的个性化特征，对发现更多种类、更多基因型、耐药、治疗效果、疫苗研发、检测有效性及研究宏基因组学均有不同程度的影响[1]。

1.1 检测未知病毒 PCR无法应用于未知病毒是其最大的限制，而NGS技术填补了此项空白。2012年荷兰研究者对1例因急性肺炎转肾衰竭而死亡的患者痰液标本进行测序从而发现了中东呼吸综合征冠状病毒[2]。2014年美国研究人员发现的新正黏病毒正是通过对受蜱虫叮咬而死亡的患者血液标本进行测序而获得的，因此在面对未知病毒所导致的疾病爆发疫情时，NGS技术总能及时协助研究者鉴定新病毒。

1.2 分析病毒遗传进化 NGS可通过对病毒基因组测序，将相同或近似种属的病毒进行比较，对毒株的来源、进化、变异实现动态监测，并对病毒是否能造成人群中流行进行预测。2016年Wang等[3]从1例腺病毒阳性的严重急性呼吸道感染(severe acute respiratory infection，SARI)患儿痰液标本中分离出腺病毒重组株(CBJ113)，将Sanger法与NGS联合对CBJ113进行系统性分析，发现该毒株与HAd V-C2、HAd V-C6、HAd V-C1、HAd V-C5、HAd VC57同源，且重组株的E4orf1与DNA多聚酶基因分别与HAd V-5和HAd V-6的对应基因高度相似，因此将其归为HAd V-C分支下的一个新亚型。

1.3 探索病毒与宿主之间相互作用 当前对于病毒感染后基因水平免疫调节的变化仍然知之甚少，为了探索临床预后与免疫调节机制之间的联系，Hou等[4]对近期感染H7N9患者的T细胞及B细胞进行深度测序，结果表明，T细胞及B细胞的所有组成成分均表现出表达水平高度活跃及独特的克隆型改变。在感染过程中，T细胞β链持续收缩，免疫球蛋白重链恢复结构多样性，预后较好的患者T细胞多样性下调而B细胞多样性更高，同时在这些病例中发现了对血凝素H7亲和的已知抗体序列，因此NGS可作为预测疾病病程及预后的有效指标而应用于临床，也可对病毒转录组、microRNA进行测序，动态检测病毒的复制过程及病毒表达蛋白的差异。

2 NGS在呼吸道细菌感染中的应用

2.1 致病菌与定植菌 在人体与外界相通的黏膜表面生存且不引起宿主反应的细菌称为定植菌。虽然定植不是感染，但可成为院内感染的来源及诱因。病原体从定植到致病的进化改变目前尚未完全明确，Young等[5]利用高通量测序探究金黄色葡萄球菌从定植进展到引起致命血流感染过程中的基因改变，从中发现了30个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphis，SNP)和4个缺失/插入变异，尽管引起菌血症的细菌与原本的无症状定植菌仅有8个突变的不同，但一半的突变可导致蛋白质断裂，其中包括与金黄色葡萄球菌致病性相关的AraC家族转录调节子中的一个提前终止密码子。分析2例无症状携带者中的细菌进化过程同样证实了蛋白质断裂对感染进展的影响。高通量技术可检测到其他技术无法探测到的病原体的少量基因突变，从而深入研究病原菌在宿主体内的进化动力学，有助于临床区分致病菌与定植菌，进行更有针对性的抗感染治疗。

2.2 耐药菌 呼吸道耐药菌群的感染随着抗生素的广泛使用而日益增多，感染耐药菌的患者预后普遍不如敏感菌感染者，且增加临床医师诊疗的压力，造成医疗资源的浪费。目前临床常见的耐药菌主要为：肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等。及时探测捕捉到耐药菌群的感染对于呼吸道感染尤其是院内感染的控制及预防意义重大。方小龙等[6]利用NGS检测246株铜绿假单胞菌菌株，其中102株显示多重耐药，21株广泛耐药株仅对多黏菌素敏感，进一步分析发现了该菌的8种耐药分型，与耐药相关基因共21个，其中17个位点存在非同义突变，在总的SNP位点中占24.6%。Snyder等[7]利用NGS对某机构6年内引起持续流行的铜绿假单胞菌株进行测序，所得数据表明最终爆发是由于单个碱基的变异累积，导致包括lasR、nrd G、tadZ等多种基因产生SNP，而Bachman等[8]通过建立小鼠肺克KPRR1致肺炎模型，在NGS的帮助下对超过25 000个转录子突变体进行插入位点测序，从而确定了超过300个基因影响小鼠感染肺炎的严重程度，其中许多基因来源于世界各地的肺炎克雷伯杆菌菌株，包括耐药株。2016年Wang等[9]使用NGS对鲍曼不动杆菌菌株MDR-SHH02进行抗生素耐药基因的检测。王娟等[10]对西京医院痰液标本分离的42株广泛耐药鲍曼不动杆菌测序其产生D类碳青霉烯酶基因Ox A-23、Ox A-51的存在情况，发现产Ox A-23碳青霉烯酶是该院下呼吸道感染的主要耐药机制从而为临床及时应用针对性抗生素提供重要依据。利用NGS可分析耐药菌的序列变化从而揭示细菌的进化过程，追踪原始突变株，及时鉴别出感染高危耐药菌的人群从而有效控制感染，并且有助于开发针对感染相关基因或耐药基因的新型抗生素。

3 在非典型菌感染中的应用

呼吸道感染中非典型菌同样占有较高的比例，如肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌等，且与常见病原菌相比，非典型菌引起的肺炎能引起更高的病死率。肺炎支原体根据P1连接分子分为type1及type 2，Diaz等[11]对来自不同时期不同地区引起爆发流行的107株肺炎支原体菌株进行测序，总共发现了超过3 000个SNP，包括520个特异性的SNP，在原有的type 1、type 2下又各自划分了3个亚组，对不同地区时期的分离株进行测序，不仅可以发现肺炎支原体的传播过程，更可区分不同地区的潜在感染人群，提前预防感染的全面爆发，对感染管控大有裨益。

4 在分枝杆菌感染中的应用

一般而言，治疗药物的优化和免疫干预的发展取决于病原体的适应性及遗传变异，但有趣的是，结核分枝杆菌尽管基因组变异较少，却依然表现出耐药特性，Copin等[12]利用NGS比较导致小鼠感染肺结核的结核分枝杆菌的遗传多样性发现，新的基因突变虽然可在体外培养过程中逐渐累积，但这些累积的突变一旦进入体内即被宿主选择净化，优势基因型依然得到保留，另外对T细胞缺陷及免疫正常的小鼠进行接种并传代结核分枝杆菌，NGS分析发现，T细胞能增加结核分枝杆菌遗传多样性。测序技术作为辅助手段，面对日益增多的耐药结核分支杆菌的感染有助于更深入地研究潜在耐药机制。Cui等[13]对178例空洞型及非空洞型肺结核患者(1∶1)、95名健康对照者的血浆样本采用NGS分析血浆样本中的miRNA表达水平，在空洞型肺结核和非空洞型肺结核患者血浆样品中共发现29种miRNA与健康对照组表达水平有差异，进一步定量反转录聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chain reaction，q RT-PCR)分析证实miR-769-5p、miR-320a和miR-22-3p在结核患者和健康对照组中表达显著不同，因此可将这3类miRNA作为结核感染的潜在血浆标志物来检测可能的患者从而减少临床漏诊。

5 在呼吸道真菌感染中的应用

随着人均寿命延长，临床医师开始面对越来越复杂的的呼吸道感染情况如使用免疫抑制剂、器官移植、化疗等，侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)的病例在近年来悄然上升，由于真菌诊断较为困难，且此类患者常合并基础疾病，因而IFI病死率较高，严重威胁着患者的健康。目前PCR是分子诊断中应用最为广泛的技术，但仅适用于已知真菌，无法鉴别未知真菌，且当前真菌的分类和命名更新换代十分迅速，因此NGS开始应用于病原真菌的鉴定。通过将所得数据进行科学分析，对真菌进化机制及生物学特征有更全面而客观的了解。2018年Xiao等[14]收集了2009年8月1日至2014年7月31日来自65家三甲医院的8 829例念珠菌菌株进行测序，共检出32种念珠菌，白色念珠菌最多(44.9%)，在这以后依次排列为近平滑念珠菌(20.0%)、热带念珠菌(17.2%)、光滑念珠菌(10.8%)，同时药敏试验发现白色念珠菌与近平滑念珠菌对氟康唑和伏立康唑敏感(＜6%的耐药率)，而热带念珠菌对氟康唑和唑类的交叉耐药性率较高(分别为13.3%和12.9%)。侵袭性肺烟曲霉病的发病率随着免疫抑制剂的应用逐年升高。通过NGS鉴定高表达的烟曲霉菌基因，并利用序列相似性和基因表达研究烟曲霉基因所分泌的蛋白质组学[12]从而有助于研究烟曲霉菌感染与宿主之间的相互作用机制。

6 结语

NGS对呼吸道感染的诊断、鉴别、预防控制、治疗及研究病原体的进化过程均有极大的参考价值，通过测序技术还可发现新的代谢途径及耐药靶点，为新药的开发提供科学依据。虽然前景可观，然而由于尚未完善菌株/毒株数据库信息，缺乏统一的标准参考序列，面对大量的数据需要专门的生物信息学研究人员进行分析整合[15]，更高效地利用NGS辅助感染治疗，评估治疗效果及预后，同时需要进一步降低运行成本使之成为临床上可广泛引用的技术手段，因此NGS仍有较广阔的发展空间，依然期待更高质高量的创新[16]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突