SIRT1、PGC-1α在原发性开角型青光眼患者小梁网组织中的表达及意义△

纪舒昱 钟华 李雷 冯诗婷

原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是临床中最常见的青光眼类型，表现为眼压升高、视神经受压、视盘供血不足、视功能损害等症状，常由小梁组织变异、静脉压增高等引起[1-2]。小梁网是房水流出的重要途径，其功能异常使房水流出受阻，导致眼压升高，是POAG发病的关键因素[3]。近年来研究表明，线粒体功能损伤和氧化应激是导致青光眼患者小梁网细胞损伤、凋亡及功能异常的重要原因，但其损伤的分子机制尚不完全清楚[4]。沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator factor 2 releated enzyme 1，SIRT1)是一种去乙酰化酶，可通过调节多种组蛋白和非组蛋白转录因子活性，发挥抵抗氧化应激、延长寿命等作用。研究报道，SIRT1在角膜、视网膜、晶状体等眼部组织中都有表达，与角膜、白内障等多种眼科疾病的发生发展相关[5]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是近年来发现的调节线粒体生物合成、促进有氧代谢的转录共激活因子，也是SIRT1的底物[6]。SIRT1和PGC-1α在POAG小梁网组织功能损伤过程中的作用尚未见相关报道。因此，本研究检测POAG患者小梁网组织中SIRT1和PGC-1α表达水平，探讨其在小梁网功能损伤中的可能作用，旨在为POAG临床治疗提供一定的理论参考。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2017年1月至2018年4月在海南医学院第一附属医院确诊为POAG的40例(40眼)患者为研究对象，其中男23例、女17例，年龄 39～62(52.76±8.59)岁。纳入标准：(1)中华医学会眼科学分会青光眼学组《我国原发性青光眼诊断和治疗专家共识》中POAG相关诊断标准[7]；(2)病理性眼压升高，视功能障碍，前房角镜检查显示房角呈开放状态；(3)患者知情并签署同意书；(4)经医院伦理委员会批准。排除标准：(1)急、慢性闭角型青光眼，青光眼睫状体炎综合征等继发性开角型青光眼；(2)虹膜睫状体炎等其他眼部疾病引起的眼压升高；(3)临床病理资料缺失或有眼部手术史。

所有患者均行小梁切除术治疗，术中切除的小梁网组织一部分立即放入液氮速冻，超低温冰箱保存，另一部分立即置入40 g·L-1多聚甲醛中固定，保存于4 ℃冰箱。另选择因故死亡成人供体眼球标本30例为对照组，切除小梁组织固定保存，方法同POAG组，排除眼部疾病或其他器官、组织恶性疾病患者。

1.2方法

1.2.1RT-PCR检测取上述超低温保存的POAG组和对照组小梁网组织，加液氮研磨，加入Trizol裂解液(美国Invitrogen公司)和氯仿(Trizol裂解液氯仿=51)，振荡混匀15 s，37 ℃孵育2 min，4 ℃下 12 000 r·min-1离心15 min，吸取上层无色液体至干净的无菌离心管中，加入等体积异丙醇混匀，37 ℃ 孵育10 min，4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，用体积分数75%乙醇清洗RNA沉淀，室温下干燥5～10 min，用无RNA酶的无菌水溶解RNA。紫外吸收法检测RNA纯度，A260/A280比值1.8～2.1。使用SuperScript Ⅳ逆转录酶(美国Invitrogen公司)合成cDNA。SYBR Green法进行RT-PCR，β-actin为内参，检测样品中SIRT1、PGC-1α mRNA表达水平。具体程序：93 ℃ 2 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，共40个循环。

1.2.2免疫组织化学染色取40 g·L-1多聚甲醛中固定的小梁网组织，使用石蜡包埋，连续切片，厚5 μm，依次放入二甲苯溶液、乙醇溶液，常规脱蜡脱水，浸入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中高温煮沸进行抗原修复，待切片自然冷却后加入内源性过氧化氢酶浸泡15 min，冲洗，分别加入一抗、二抗反应。采用链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶标法显色，苏木精溶液复染。染色过程中保持切片湿润。结果以出现棕黄色颗粒为阳性表达，无棕黄色颗粒为阴性表达。

1.2.3氧化应激酶检测按照试剂盒说明书检测小梁网组织中过氧化物酶(peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。POD测定试剂盒(比色法)购于南京建成生物工程研究所，总SOD活性检测试剂盒(比色法)购于上海碧云天生物技术有限公司。

2 结果

2.1小梁网组织中SIRT1、PGC-1α的mRNA表达水平POAG组小梁网组织中SIRT1 mRNA和PGC-1α mRNA表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

2.2免疫组织化学染色结果免疫组织化学染色结果显示，SIRT1和PGC-1α在小梁网组织中均有表达。SIRT1和PGC-1α主要在细胞质和细胞核中表达，且对照组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α阳性表达率高于POAG组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α(P<0.05)。见图1。

图1 免疫组织化学染色检测小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达(×400)。A、C为对照组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达；B、D为POAG组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达

表1两组小梁网组织中SIRT1、PGC-1αmRNA表达水平

组别nSIRT1 mRNAPGC-1α mRNA对照组300.24±0.070.67±0.21POAG组400.11±0.030.32±0.10t值10.5449.250P值0.0000.000

2.3POAG组小梁网组织中SIRT1和PGC-1α表达的关系相关性分析显示，POAG组小梁网组织中SIRT1与PGC-1α表达呈正相关关系(r=0.759，P=0.006)。见图2。

图2 POAG组小梁网组织中SIRT1和PGC-1α的表达相关性分析图

2.4小梁网组织中POD和SOD水平POAG组小梁网组织中POD水平高于对照组，SOD水平低于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表2。

表2两组小梁网组织中POD和SOD水平

组别nPOD水平/U·L-1SOD水平/U·L-1对照组30(73.46±15.81)×103412.57±61.25POAG组40(102.59±22.37)×103347.62±50.73t值6.0794.849P值0.0000.000

2.5POAG组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达与POD、SOD的关系POAG组小梁网组织中SIRT1表达水平与POD水平呈负相关关系(r=-0.636，P=0.009)，与SOD水平呈正相关关系(r=0.662，P=0.005)；POAG组小梁网组织中PGC-1α表达水平与POD水平呈负相关关系(r=-0.737，P=0.000)，与SOD水平呈正相关关系(r=0.614，P=0.014)。见图3。

3 讨论

POAG是一种病理性眼压升高且前房角开放的青光眼，以视盘受损和视野障碍为主要特征。流行病学研究表明，眼压≥20 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的患者发生POAG的风险是眼压<20 mmHg患者的16.22倍，说明高眼压是POAG的主要病理因素[8]。小梁网位于眼前段并且负责调节房水的流出，青光眼中可观察到小梁网细胞外基质超微结构变化，并且有大量基因突变，小梁网硬度增大，说明小梁网组织变性、硬化、内皮细胞增大等变异是POAG眼压增高的主要原因，眼压升高进而引起小梁网压缩，导致小梁网细胞外基质沉积，增加POAG患眼房水流出阻力[9-10]。因此，探讨小梁网组织病变机制对临床POAG降眼压治疗具有一定的指导意义。

SIRT1是细胞代谢辅酶NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，有研究表明，H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化应激中SIRT1表达明显降低，而上调SIRT1表达可减缓氧化应激对人晶状体上皮细胞增殖、凋亡的影响[11]。Ren等[12]研究发现，青光眼小梁网细胞中SIRT1表达低于正常小梁网细胞，使用H2O2诱导正常小梁网细胞DNA双链损伤，并将SIRT1转染至受损细胞，发现SIRT1转染后受损细胞修复能力增强，细胞衰老延缓，提示SIRT1表达下调可能是青光眼发病危险因素之一。说明SIRT1在小梁网组织中有表达，且具有抗氧化应激作用。本研究结果发现，POAG患者小梁网组织中SIRT1表达水平明显低于正常小梁网组织，与Ren等[12]研究结果一致。PGC-1α是调节线粒体生物合成和能量代谢的关键分子，本研究结果发现，POAG患者小梁网组织中PGC-1α表达水平明显低于正常小梁网组织。免疫组织化学染色结果显示，POAG患者小梁网组织中SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平均降低。白藜芦醇是SIRT1的天然激动剂，有研究表明，白藜芦醇能够改善高糖对视网膜血管内皮细胞线粒体DNA的损伤作用，通过激活PGC-1α和线粒体转录因子A信号通路改善线粒体功能[13]。

图3 POAG组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达与POD、SOD水平的相关性分析图。A、B为SIRT1表达与POD、SOD的相关性分析图；C、D为PGC-1α表达与POD、SOD的相关性分析图

POAG患者小梁网细胞中升高的Ca2+浓度可进入线粒体，引起线粒体通透性改变、有氧呼吸功能障碍，产生较多的活性氧，进而通过一系列反馈调节机制促进小梁网细胞凋亡，导致POAG患者小梁网功能障碍及眼压升高，引起视神经损伤和视野缺损[14-15]。线粒体产生的活性氧是体内氧化应激水平的重要促进因素，加强的氧化应激可从多种途径造成小梁网细胞DNA和溶酶体损伤，引起小梁网细胞死亡[16-17]。此外，活性氧还可促进核因子激活，白细胞介素等炎症因子产生，引起小梁网细胞结构和功能改变[18]。本研究结果发现，POAG患者小梁网组织中促氧化标志物POD水平升高，而抗氧化标志物SOD水平降低，说明小梁网组织中存在氧化应激状态。Fu等[19]研究表明，SIRT1的天然激动剂白藜芦醇能够促进线粒体内SIRT1富集，并上调FoxO3a介导的PGC-1α基因表达，有效降低小鼠肾小管上皮细胞中线粒体活性氧产生。Fang等[20]研究表明，白藜芦醇通过激活SIRT1介导的PGC-1α去乙酰化可改善线粒体功能，从而减轻糖尿病小鼠中高葡萄糖诱导的心脏氧化应激。本研究相关性分析显示，POAG患者小梁网组织中SIRT1水平与PGC-1α水平呈正相关，且SIRT1和PGC-1α与小梁网组织中异常表达的POD、SOD有关，可推测氧化应激导致SIRT1低表达，降低PGC-1α表达导致线粒体活性氧产生增加，进而加重氧化应激水平，形成恶性循环，促进POAG发生及进展。

综上所述，POAG小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达降低，与氧化应激状态有关，提示SIRT1、PGC-1α在POAG发生发展中起重要作用。通过激活SIRT1/PGC-1α信号途径可能改善小梁网组织线粒体功能，降低氧化应激水平，进而降低眼压，实现控制及改善POAG，为临床治疗POAG提供了新思路，但其治疗效应仍需进一步临床验证。