基于体外培养法研究不同GI指数的粗饲料与精饲料之间组合效应

2019-03-15杨洪明张轶凤许宏杨王向明刘宇宸杨晓明齐智利

草业科学 2019年2期

杨洪明，王宇，张轶凤，李晗，许宏杨，王向明，刘宇宸，杨晓明，齐智利

（1. 华中农业大学动物营养与饲料科学系，湖北武汉 430070；2. 恩施市金欣农业发展有限公司，湖北恩施 445033）

反刍动物生产主要依赖于牧草、农作物秸秆、酒糟等粗饲料[1-2]。在反刍动物日粮中，粗饲料通常占60%～70%，甚至更高，是瘤胃微生物和宿主动物重要营养来源。粗饲料的品质对反刍动物生产性能和健康有重要影响，并直接影响精料的供给量与成本，最终影响到生产者的效益。迄今，动物营养领域对粗饲料科学利用方面的研究还远远不够[3]。在实际生产中，重精料不重视粗饲料科学利用的问题也相当普遍。随着畜牧业生产经营方式的转变，牛羊舍饲比例的增加，粗饲料在动物生产实践中的地位就尤显重要，如何提高粗饲料的采食量及消化率是粗饲料科学利用的重中之重，过去人们尝试了各种方法来提高粗料尤其是秸秆的利用率，包括化学处理、物理处理、微生物处理及盲目的补饲[4]，但这不符合动物自身的生长规律及营养需要，同时大部分化学处理法对环境造成了极大的危害，这就背离了我们正大力提倡的绿色营养这一可持续发展战略。

目前，国内外在粗饲料的利用上大多依靠加工调制，较少考虑动物自身存在的营养潜力及饲料间的组合效应。组合效应是指当不同粗饲料共同饲喂时，它们所提供的营养素就会发生互作，从而改变了随后在动物体内的代谢过程。通过互作使日粮内某种利用率或采食量指标高于各个饲料相应指标的加权值，称之为“正组合效应”；反之，低于各个饲料相应指标的加权值，则称之为“负组合效应”[5]。越来越多的研究表明[6-7]，动物采食水平、日粮蛋白质补充料、易降解纤维、易发酵碳水化合物和脂肪的添加，以及饲料间的不同搭配组合、加工调制方法和一些营养调控措施等均会改变单个饲料的消化率和利用率，组合日粮的表观消化率并不等于日粮中各饲料组分表观消化率的加权平均值，不同饲料之间确实存在组合效应。

目前评定组合效应所用指标单一，尚没有对瘤胃发酵产物进行过全面、综合评价的方法，仅是以单纯的补饲进行采食量和消化率等指标的测定。用人工瘤胃产气法又局限于产气量的研究或两种指标(如将产气量和微生物蛋白结合起来)的定性比较，评定结果差异很大。Blümmel等[8]曾将发酵残留物与产气量结合起来进行评定。但是由于之前报道所用指标少、片面，不能真实描述饲料间尤其是粗饲料间的组合效应。因此，张吉鹍[9]提出用多项指标综合指数 (multiple-factors associative effects index, MFAEI)将人工瘤胃产气法各时间点所测的各项指标综合后来评定饲料间的组合效应。MFAEI的特点是动态性、综合性、量化描述，可对饲料间组合效应进行整体量化，从而直观地反映饲料间组合效应的大小。此外，卢德勋[10]根据我国粗饲料利用的现状，以系统科学为指导思想，在广泛吸取相对饲喂价值 (relative feed value, RFV)等粗饲料评定指数的优点的基础上，结合我国粗饲料生产及利用的实际，适时地提出了评定粗饲料品质的粗饲料分级指数 (grading index, GI)。GI指数不仅可以对粗饲料品质进行合理分级、评定，而且为粗饲料科学搭配提供了一项新的技术手段。GI指数可充分发挥粗饲料营养素互补的生产潜力，从而提高粗饲料的利用率，优化动物生产[11]。本研究对反刍动物常用饲料[玉米(Zea mays)青贮、啤酒糟、羊草(Leymus chinensis)、稻秸及精料)采用体外(in vitro)培养法来探讨粗饲料之间的组合效应及粗饲料与精料之间的组合效应，旨在为反刍动物的日粮配制和饲养实践提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用饲料

玉米青贮、羊草、啤酒糟和稻秸样品采集于湖北省各奶牛场；样品采集后，以四分法取样。样品在烘箱中65 ℃下烘干，剪成1 cm左右小段，粉碎，过孔径0.425 mm筛以备进行化学成分分析和消化试验，分别制样100 g保存备用。

1.1.2 试验用瘤胃液供体动物

选 5 只体况良好、体重相近 (20 ± 2) kg、安装永久性瘤胃瘘管的健康马头山羊供采集瘤胃液用。试验羊日粮配制参照NY/T 816-2004肉羊饲养标准[12]肉山羊饲养标准，基础日粮组成和营养水平如表1所列。试验羊单笼饲养，每天于06:00和18:00两次饲喂，先喂精料，后喂粗料，自由饮水，常规光照、驱虫与管理。

表1 试验用瘤胃液供体羊基础日粮的组成与营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of sheep diet

1.2 试验方法

1.2.1 单一粗饲料在瘤胃中动态发酵规律的研究

试验采用单因素试验设计，分别对4种粗料取样0.5 g进行体外2、6、12和24 h培养，以确定单种粗料各个时间点pH、产气量、干物质(dry matter,DM)消化率和中性洗涤纤维 (neutral detergent fiber,NDF)消化率。

主体为往复式恒温水浴摇床，培养瓶瓶口安装橡皮塞，用一次性注射器联通，以保证培养瓶的厌氧状态。注射器每次使用之前洗净、晾干，然后用少量液体石蜡涂在活塞筒的四周，以防漏气，而且可尽量减少气体产生过程中活塞向上移动的阻力。用预热39 ℃并通有CO2的保暖壶取用纱布过滤的瘤胃液，立即盖紧密封，迅速送回实验室。持续通入 CO25 min，按瘤胃液为 1∶2的比例充分混合后，配制成培养液，并快速分装至每个培养管。分装完毕后再向每个培养管充入CO2气体1～2 min。在各试验点培养结束后，记录各个样品的产气量。然后取出培养瓶，测量培养液的pH。之后将溶液无损地转移到尼龙袋中过滤。65 ℃烘干至恒重以测定其干物质含量。记录各时间点的产气量，当注射器刻度达到20 mL时排出气体，使刻度回到5 mL的位置。用PHS-25型数显酸度计数字酸度计测定pH，并测定DM和NDF消化率。

1.2.2 不同饲料之间的组合效应研究

根据前期试验测定的数据，各个饲料GI指数由高到低依次是啤酒糟(11.02) 、玉米青贮(2.86) 、羊草(1.55) 和稻草(0.85)。综合每种饲料的特点及这3种饲料在湖北省实际的搭配情况及GI指数，设计3种饲料组合，研究其组合效应，为反刍动物生产实践提供科学依据和方法。

试验采用单因素试验设计，饲料按配方混合好后分别取样 0.5 g进行体外 2、6、12和 24 h培养，以确定混合饲料各项体外指标(同试验1.2.1)。

3种组合：1)玉米青贮和啤酒糟(高GI组合)；2)玉米青贮和羊草(高、低GI组合)；3)羊草和稻秸 (低 GI组合)(表 2)。

表2 不同饲料之间的组合比例Table 2 Combination of different feeds

1.2.3 精饲料与不同GI指数的混合粗饲料之间组合效应的研究

试验采用单因素试验设计，饲料按配方混合好后分别取样 0.5 g进行体外 2、6、12和 24 h培养，以确定混合饲料各项体外指标。(同试验1.2.1，混合比例同表2所列)。

1.2.4 组合效应计算方法

式中：SFAEI表示单项组合效应值，A1系单一粗料各个培养时间点各指标数值；A2为混合饲料各个培养时间点各指标数值；A3是在每个时间点A2总和的平均数。

MFAEI为各单项指标的加和值。

1.3 统计分析

本研究所有数据采用Excel 2007进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单一粗饲料发酵对瘤胃pH、瘤胃产气量、干物质瘤胃消化率动态变化的影响

随着发酵时间的延长，培养液的pH逐渐下降，当达到24 h时，下降趋势趋于平稳。瘤胃培养液的产气量呈逐渐增加趋势(表3)。在24 h内，玉米青贮的产气量最高，稻秸的产气量最低；玉米青贮干物质消化率和NDF消化率明显高于其他3种饲料，而且消化速度很快，其pH下降幅度却明显低于其他3种饲料，说明玉米青贮的干物质消化率和培养液pH有直接关系。

2.2 各单一粗饲料相加后的组合效应

3个组合都产生了正组合效应(表4)。从单项组合效应来看，产气量产生的组合效应最为明显。对于产气量SFAEI来说，以羊草和稻秸组合最大，为0.40。pH产生的组合效应值最为微弱。从组合效应MFAEI来看，玉米青贮和啤酒糟最小，为0.29。玉米青贮和羊草组合以及羊草和稻秸组合综合组合效应一样，均为0.54。

2.3 粗饲料之间的组合效应

随着培养时间的延长，培养液的pH逐渐下降，当达到24 h时趋势趋于平稳(表5)。玉米青贮和啤酒糟组合pH下降幅度小于其他两个组合，羊草和稻秸组合的pH下降幅度最大。

瘤胃培养液的产气量逐渐增加。前期玉米青贮和羊草组合产气量较多，速度较快。但玉米青贮和啤酒糟组合后期产气速度加快，24 h产气量反而最多。羊草和稻秸组合产气量最小。

瘤胃培养液中混合饲料干物质消化率逐渐增加。粗粗组合干物质消化率和其产气量的变化趋势是一致的。玉米青贮和羊草组合，在前期消化较快，而玉米青贮和啤酒糟组合在后期消化速度加快，24 h消化率最高。羊草和稻秸组合消化率最低。饲料产气量和饲料干物质消化率在趋势上保持高度一致。

随着饲料培养时间的延长，瘤胃中混合饲料的NDF消化率逐渐增加；玉米青贮和啤酒糟组合24 h消化率最高，0-12 h玉米青贮和羊草组合消化率增加速度最快，羊草和稻秸组合消化率最低(表5)。混合饲料的干物质消化率和NDF消化率的趋势高度的一致。

2.4 粗精混合饲料发酵对瘤胃pH、瘤胃产气量、干物质瘤胃消化率动态变化的影响

随着培养时间的延长，瘤胃培养液的pH逐渐下降，当达到24 h时趋势趋于平稳；玉米青贮、羊草和精料组合pH下降幅度最大，羊草、稻秸和精料组合pH幅度下降最小；在6-12 h这段时间，3组饲料pH变化幅度不大(表6)。瘤胃中的产气量逐渐增加；玉米青贮、羊草和精料组合24 h产气量最高，对比玉米青贮和羊草组合，加了精料后，产气量明显增加。

表3 单一粗料各个时间点pH、产气量、干物质消化率、NDF消化率Table 3 pH value, gas production, dry matter digestibility, and NDF digestibility in single roughage at each point of time

表4 针对混合饲料“相加性”的组合效应Table 4 “Additive” combination effects of mixed feed

玉米青贮、啤酒糟和精料组合24 h干物质消化率最高。与没加精料的组合相比，加了精料后，饲料发酵速度明显加快。饲料产气量和饲料干物质消化率在趋势一致。

粗料和精料之间出现了明显的组合效应(表6)。SFAEI以产气量最为明显，玉米青贮、羊草和精料组合最大，为0.30。pH的组合效应值最为微弱。

综合组合效应值以羊草、稻秸和精料组合(MFAEI为0.37)及玉米青贮、羊草和精料组合(MFAEI为0.36)较大。这说明，精料的添加对粗饲料的发酵能力有很大的改善。特别对低GI指数组合羊草和稻秸组合的改善作用更大。对高GI指数组合玉米青贮和啤酒糟组合的改善能力较低GI指数组合要差。本部分试验证明了粗精饲料之间有着明显的正组合效应。单项组合效应值以产气量最为明显。pH值单项组合效应值最为微弱。精饲料的加入可以明显改善反刍动物对粗饲料的利用情况。尤其对低GI指数组合羊草-稻秸组合的改善能力更强。

表5 粗粗组合各个时间点pH、产气量、干物质消化率、NDF消化率Table 5 pH value, gas production, dry matter digestibility, and NDF digestibility in roughage-roughage combinations at each time point

表6 粗精组合各个时间点pH、产气量、干物质消化率Table 6 pH, gas production, dry matter digestibility in roughage-concentrate combinations at each time point

3 讨论与结论

3.1 关于产气量、干物质消化率和NDF消化率之间关系

本研究中，产气量和干物质消化率的趋势保持高度的一致。吴跃明等[13]利用体外产气技术研究了桑叶(Morus alba)与各种饼粕类饲料间的组合效应，发现用产气量评定的结果同用消化率评定的结果在趋势上高度一致，他认为可以直接用气体产量评定饲料间的组合效应，这表明产气量能在很大程度上反映饲料间的组合效应。此外，本研究还发现NDF消化率和干物质消化率的趋势保持高度的一致。而这4种饲料的NDF含量(风干基础)都很高，玉米青贮为77.11%，啤酒糟为63.21%，羊草为70.00%，稻草75.12%。张轶凤等[7]研究发现，稻草、羊草、玉米青贮的干物质消化率与NDF的消化率有一致的趋势变化，这与本研究的结果一致。所以可以推测，在NDF含量很高的饲料中，干物质消化率能够反映出NDF的消化率。

3.2 关于pH组合效应的讨论

本研究中，pH的组合效应都最为微弱，产气量的组合效应值一般是pH效应值的10倍以上。王旭[14]、张吉鹍等[15]均报道在分析组合效应值时未考虑pH的组合效应，这与本研究的结果一致，因此在进行组合效应值时可以不予考虑pH的综合效应值。但pH与瘤胃微生物的生物活性有着十分密切的关系，因此仍需要测定pH以及其变化趋势，间接说明饲料的组合效应。

3.3 关于测定饲料组合效应的技术研究

当前评定饲料组合效应主要包括以下几种技术：1)体内法：体内法要测定的是动物采食量、消化率和利用率，并以此评估饲料间的组合效应。但是体内法需要大量的饲料、动物并消耗大量的人力、物力、财力，限制它的使用。且动物差异性较大，导致试验的可重复性差。2)半体内法：半体内法同样由于动物和尼龙袋的差异导致可重复性差，限制了其使用范围。3)体外消化法：即人工瘤胃产气法，该方法简单易行，重复性好、易于标准化，实行批量操作、测试。与半体内技术相比，产气技术对动物依赖性小，对可溶性物质和小颗粒饲料有更精确的估测，且自动化程度高，减少了劳动力的投入。它同样可获得消化率和消化程度、挥发性降解产物量及微生物蛋白产生量。本研究采用的是人工瘤胃产气法。将加入饲料的瘤胃培养液在体外培养24 h，测定饲料在不同时期的各个参数，能够更加准确地分析各饲料之间的组合效应。

3.4 关于饲料组合效应评定指标的相关研究

现在评定粗饲料间组合效应的指标有多种。最常用的有采食量指标、消化率指标和利用率指标等。Blümmel等[8]曾建议将发酵残留物与产气量结合起来进行评定。由美国全国饲草测试协会(National Forage Testing Association)确认的粗饲料相对值，目前还在美国管理、生产、流通和交易等各个领域广泛使用着，而我国至今尚缺乏这方面的技术。目前采用的技术指标少、片面，不能真实地描述饲料间尤其是粗饲料间的组合效应。

为此，卢德勋[16]在继承RFV合理内涵的基础上，提出了全新的粗饲料评定指数GI，除引入能量参数外，还引入了粗蛋白(crude protein, CP)与粗饲料干物质随意采食量 (dry matter intake, DMI)等参数，首次将它们统一起来考虑，使其更具生物学意义。红敏等[17]通过体外试验比较新一代GI2008和GI，结果发现，GI2008与GI均能对粗饲料品质进行科学的评定。但在实际应用中，本研究所采用的GI指标简便易行，更具有应用前景[18]。并且GI指数在反刍动物生产领域已经被广泛推广，取得了巨大的经济效益[19-26]。所以，本研究采用的GI指数既体现了整体性，又反映了动态性与针对性，是一个集理论性与实践性于一体的粗饲料品质评定、分级指数。

此外，杨志林等[27]提出用MFAEI将人工瘤胃产气法各时间点所测的各项指标综合后来评定饲料间的组合效应。MFAEI的特点是动态性、综合性、可量化描述。本研究采用的MFAEI，通过测定pH、产气量、干物质消化率、NDF消化率来评定组合效应的指标，可对饲料间组合效应进行整体量化，从而直观地反映饲料间组合效应的大小。