乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋茎叶青贮发酵品质的影响

2019-03-15王宪举魏海燕吕世奇张娇娇丁路明

草业科学 2019年2期

闫琦，王宪举，魏海燕，吕世奇，张娇娇，丁路明

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学生命科学学院 /兰州大学旱区农业与生态修复教育部工程研究中心，甘肃兰州 730020）

菊芋(Helianthus tuberosus)又名洋姜、鬼子姜，具有耐寒抗旱、耐贫瘠、耐病、抗逆性强等特点，是一种能利用多年的粗放型植物，目前已在我国大部分地区广泛种植[1-3]。因其地上茎叶丰富、产量高、适口性好且营养价值丰富，被用作一种优质的粗饲料[4]。传统的利用方式以晾制干草为主，但在晾晒过程中使菊芋茎叶中粗蛋白含量、适口性和消化率下降，降低了饲料的利用率[5]，而且收割和晾晒受天气条件限制。青贮是贮藏青绿饲料，保存其营养价值的良好方法。青贮可以解决其在调制干草过程中叶片脱落和雨淋造成的营养物质损失，并且青贮饲料柔软多汁、气味芳香、适口性好、可长期保存，一年四季均可供应，是解决牛、羊全年所需青饲料的有效途径[6]，对发展菊芋产业和草地畜牧业有着重要的意义。

关于青贮，近年来的研究主要集中在提高青贮发酵品质的添加剂，如微生物制剂、酶制剂、有机酸、糖类等，其中以乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)为主的微生物制剂因其能有效提高青贮发酵性能而备受瞩目[7-8]。张相伦等[9]研究表明，全株玉米(Zea mays)青贮中添加乳酸菌能有效降低霉菌含量、氨态氮含量，提高粗蛋白含量，从而提高其营养价值。薛艳林等[1]对菊芋青贮添加生物制剂研究表明，添加乳酸菌可改善青贮品质，而添加纤维素酶对发酵品质没有改善效果。目前，关于乳酸菌添加剂对菊芋青贮品质的研究较少，而且对于不同生育期的菊芋来说，添加乳酸菌对其青贮品质的影响尚未见报道。因此，本研究以兰州大学榆中校区植物种质资源圃种植的菊芋为研究对象，分别在不同时期收割后添加乳酸菌调制青贮饲料，探讨乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋青贮品质的影响，为菊芋青贮饲料加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为兰州大学榆中校区植物种质资源圃 (35°56′ N，104°09′ E，海拔 1 700 m)种植的菊芋，品种为LZJ119。在菊芋不同生育期(孕蕾前期、开花期)刈割后，带至实验室，切碎1～2 cm后，阴干，待其含水量下降到65%左右后进行青贮[10]。青贮原料化学成分如表1所列。

表1 菊芋茎叶原样的化学成分(干物质基础)Table 1 Chemical compositions of Jerusalem artichoke stems and leaves (DM basis)

乳酸菌添加剂购自台湾亚芯生物技术有限公司，主要成分为植物乳杆菌LP70(Lactobacillus plantarum LP70)1 × 109cfu·g-1，总乳酸菌数 1.0 × 1011cfu·g-1。

1.2 青贮调制

试验于2017年7-10月进行。采用双因素完全随机设计，其中一个因素是菊芋的生育期，分别为孕蕾前期和开花期；另一个因素是添加乳酸菌，分别为不添加 (CK)和添加 5 × 106cfu·g-1LAB，共4个处理，每处理重复3次。将切碎至1～2 cm不同生育期的菊芋原料与添加剂混合均匀后，装入 30 cm × 23 cm 聚乙烯青贮袋中，每袋约填装 330 g，之后用真空包装机抽真空封口，置于常温避光条件下贮藏发酵，于60 d后，开封混匀青贮饲料，取样分析发酵品质及营养成分[3]。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 感官测定

按照德国农业协会(DLG)青贮评分标准及等级评定方法，从色泽、气味、质地等方面对试验后菊芋青贮进行综合评定[3, 11]。

1.3.2 发酵品质分析

取20 g青贮鲜样，加入180 mL去离子水，用榨汁机搅碎1 min，然后用4层纱布过滤，得到青贮饲料滤液，-20 ℃保存待测，用于测定pH、乳酸 (lactic acid，LA)、乙酸 (acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid， PA)、丁酸 (butyric acid， BA)含量。pH用雷磁PHS-29A型pH计测定；滤液3 500 r·min-1离心 15 min，经 0.22 μm 滤膜过滤，用高效液相色谱仪(SHI-MADZE-10A)分析滤液中LA、AA、PA、BA含量，色谱柱为ShodexRspak KC-811S-DVB gel Column 300 mm × 8 mm，流动相为 3 mmol·L-1高氯酸，流速为 1 mL·min-1，进样量为 5 μL，柱温 50 ℃，检测波长 210 nm[1, 10]。

1.3.3 营养成分分析

营养成分分析参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[12]，取新鲜青贮料65 ℃烘干至恒重，测得初水分，再将样品粉碎，取粉碎样在105 ℃下烘干后测定干物质 (dry matter, DM)含量；粗蛋白(crude protein, CP)含量使用凯氏定氮仪 (JK-9830，中国)测定；粗灰分 (crude ash, Ash)用 550 ℃ 高温灼烧法测定；中性洗涤纤维 (neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维 (acid detergent fiber，ADF)使用纤维分析仪(ANKOM -2000i，美国)进行测定；总单宁(Tannin)的测定利用Folin-Ciocalteu法，冻干鲜样测定；可溶性糖 (water soluble carbohydrates,WSC)含量使用分光光度计蒽酮-硫酸法进行比色测定；氨态氮(ammonia-nitrogen, NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定。青贮原样营养成分测试方法与青贮样相同。

1.3.4 体外干物质消化率测定

用ANKOM DAISY II体外模拟培养箱测定饲料体外干物质消化率 (in vitro dry matter digestibility，IVDMD)[13-14]。首先配制缓冲液A和B(A：KH2PO410 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1， NaCl 0.5 g·L-1,CaCl2·2H2O 0.1 g·L-1，尿素 0.5 g·L-1；B: Na2CO315 g·L-1，Na2S·9H2O 1 g·L-1)，将缓冲液 A 和 B 进行预热(39 ℃)，之后先向消化瓶中加入缓冲液A 1 330 mL，然后向其中加 266 mL 缓冲液 B(比例为1∶5)，混合液pH调制6.8。于屠宰场进行牦牛瘤胃液采集，将采集瘤胃液混合，每个消化瓶中加400 mL，之后将提前分装在 F57滤袋的 500 mg待测样品放入消化瓶，每个消化瓶加25个左右，平衡分布在消化瓶两侧，同时至少包括一个空白滤袋，然后向消化瓶中通CO2气体30 s，盖好盖子，放入ANKOM体外培养箱。48 h后取出滤袋洗净，65 ℃烘箱中烘干48 h，称至恒重，进行干物质消化率测定。青贮原样营养成分测试方法与青贮样相同。

体外干物质消化率 = [(m × w) - (m1- m0)]/(m ×w) × 100%。

式中：m0为空白干物质量 (g)，m 为样品质量(g)，m1为体外消化后滤袋重 (g)，w为消化前样品干物质含量。

1.4 数据分析

采用Excel 2010做基础数据处理，用SPSS 22.0对数据进行方差分析，并用邓肯法(Duncan)对生长时期、乳酸菌添加剂及二者之间的交互作用进行多重比较。结果表示为平均值 ± 标准误。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋茎叶青贮感官评价指标的影响

各组菊芋青贮气味、结构、色泽及综合评分均无显著差异 (P ＞ 0.05)(表 2)。综合评分都在 16～20分，均为优等青贮饲料[11]。

2.2 乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋茎叶青贮发酵品质的影响

菊芋开花期茎叶青贮后pH显著低于孕蕾前期(P＜0.05)(表 3)，乳酸含量显著高于孕蕾前期，开花期添加乳酸菌组较空白组乳酸含量显著升高，而孕蕾前期添加乳酸菌后显著降低了青贮饲料乳酸含量。乳酸菌添加剂处理在两个生育期能够显著提高乙酸含量，4个处理中，菊芋孕蕾前期添加乳酸菌乙酸含量最高，而开花期对照组的乙酸含量最低，其他两个处理组的乙酸含量则处于中间水平。生育期、乳酸菌添加剂及二者的交互作用对青贮饲料的氨态氮/总氮值均有显著影响。孕蕾前期，乳酸菌添加组氨态氮/总氮值显著升高，而在开花期其含量显著降低。

表2 生育期和乳酸菌添加剂对菊芋青贮感官评价指标的影响Table 2 Effect of lactic acid bacteria addition on the silage quality of Jerusalem artichoke stem and leaf based on sensory evaluation

表3 乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋茎叶青贮发酵品质的影响Table 3 Effect of lactic acid bacteria additive on the fermentation characteristics of Jerusalem artichoke stem and leaf silage from different growth stages

2.3 乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋茎叶青贮营养成分的影响

生育期对菊芋茎叶青贮的粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分、可溶性糖、单宁含量均有显著影响(P＜0.05)，对相对饲用价值无显著影响。在菊芋孕蕾前期，其茎叶青贮后粗灰分含量显著高于开花期，而可溶性糖含量显著低于开花期 (表 4)。

表4 生育期和乳酸菌添加剂对菊芋青贮营养成分的影响Table 4 Effect of lactic acid bacteria addition on chemical composition of Jerusalem artichoke silage from different growth stages

乳酸菌添加剂处理对菊芋茎叶青贮中性洗涤纤维、粗灰分、可溶性糖和单宁含量没有显著影响(P ＞ 0.05)，对其他营养指标影响显著 (P＜0.05)。在菊芋孕蕾前期，添加乳酸菌后显著降低了其茎叶青贮的粗蛋白，而对开花期没有显著影响。

2.4 乳酸菌添加剂对不同生育期菊芋茎叶青贮体外干物质消化率的影响

生育期、乳酸菌添加剂及二者的交互作用对青贮饲料的体外干物质消化率均有显著影响(P＜0.05)。在菊芋不同生育期，添加乳酸菌后均显著降低菊芋茎叶青贮后干物质消化率，较对照组分别降低了7.46%和4.60%。在菊芋不同生育期，添加乳酸菌组茎叶青贮体外干物质消化率均显著低于孕蕾前期。

3 讨论

3.1 生育期对菊芋茎叶青贮发酵品质、营养成分及消化率的影响

菊芋在不同生育期其营养物质含量有所不同[16]，因此，在做青贮时，植株的生育期是一个很重要的影响因素。本研究中，生育期对青贮饲料pH、乳酸、乙酸、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分、可溶性糖、单宁含量、氨态氮/总氮及干物质消化率都产生显著影响(P＜0.05)。有机酸含量是评价青贮发酵品质的重要指标[17]，发酵后，pH越低，乳酸含量越高，青贮越容易保存；粗蛋白、粗纤维、可溶性糖含量是重要的营养指标。本研究中，与孕蕾前期相比，开花期青贮饲料有较低的pH和较高的乳酸含量，发酵品质较好，可能原因是开花期菊芋青贮原料较孕蕾前期有较高的可溶性糖含量，可溶性糖是乳酸菌发酵的物质基础，充足的发酵底物确保乳酸菌大量生成乳酸，加快青贮饲料酸化过程，促使pH迅速下降，有效抑制不良发酵，提高青贮品质[18]。在营养价值方面，开花期较孕蕾前期有较低的粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分含量，较高的可溶性糖、单宁含量及相对饲用价值。随着生育期的推进，菊芋茎叶青贮粗蛋白含量降低，可能是由于植物原料成熟过程中叶绿素等蛋白类物质的降解引起[19]。

3.2 乳酸菌添加剂对菊芋青贮发酵品质、营养成分及消化率的影响

影响青贮发酵品质的因素有很多，包括原料的水分含量、可溶性碳水化合物含量、青贮温度、原料表面微生物等[20]。目前，乳酸菌作为添加剂改善青贮品质在牧草青贮中已广泛使用。很多研究表明，牧草青贮时添加乳酸菌可促进青贮乳酸菌的快速积累，降低pH和蛋白质分解，获得优质的青贮饲料[21-22]。但本研究发现，乳酸菌添加剂对青贮饲料乙酸、粗蛋白含量、氨态氮/总氮值及干物质消化率产生显著影响(P＜0.05)，孕蕾前期添加乳酸菌显著降低青贮饲料乳酸、粗蛋白含量及干物质消化率，乙酸、氨态氮/总氮值显著升高。氨态氮/总氮值被广泛用于衡量青贮品质的好坏，发酵时，植物本身的蛋白分解酶将植物蛋白分解成氨，是造成蛋白质损失的主要原因之一[11, 23]，孕蕾前期添加乳酸菌青贮饲料中氨态氮/总氮值较其他组显著增加，粗蛋白含量显著降低，说明孕蕾前期添加乳酸菌青贮饲料中不良发酵较多，粗蛋白降解率较高。综合以上发酵品质和营养成分，本研究在菊芋孕蕾前期青贮中添加LAB未得到积极的效果，与薛艳林等[1]、张涛等[21]的研究结论不一致，但也有研究报道，接种乳酸菌对青贮品质没有显著影响甚至会降低青贮品质[24-26]。本研究在菊芋孕蕾前期接种乳酸菌并没有对青贮产生积极效果的可能原因是在青贮发酵初期，首先牧草附着的好氧细菌、酵母及霉菌等利用残留氧气进行繁殖，随着氧气耗尽，更具竞争力、更能适应环境的自身乳酸菌以菊芋原料丰富的可溶性糖为底物迅速繁殖，主导青贮过程，额外添加乳酸菌可能会与自身附着乳酸菌产生竞争作用，从而抑制乳酸的生成，进而影响青贮饲料品质[27]。但在开花期，青贮饲料添加乳酸菌使pH、氨态氮/总氮显著降低，乳酸、乙酸含量显著升高对其他指标均无显著影响(P ＞ 0.05)，说明在菊芋开花期做青贮饲料时，添加乳酸菌能使青贮料迅速处于酸性环境，减少了粗蛋白的分解，使其具有较高的发酵品质。可能原因是，开花期菊芋具有较高的可溶性糖含量，发酵时，由于自身乳酸菌含量不足，外源添加乳酸菌迅速利用底物进行发酵，产生乳酸，改善青贮饲料发酵品质，利于饲料保存；但其体外干物质消化率却显著低于空白组，这可能与开花期具有较高的纤维含量有关[28]。

3.3 乳酸菌和生育期对菊芋青贮发酵品质、营养成分及消化率的影响

菊芋生育期和乳酸菌添加剂二者的交互作用对青贮饲料乳酸、乙酸、粗蛋白含量，氨态氮/总氮值及干物质消化率产生显著影响(P＜0.05)。孕蕾前期添加乳酸菌显著降低青贮饲料乳酸、粗蛋白含量及干物质消化率，乙酸、氨态氮/总氮值显著升高；开花期添加乳酸菌其青贮饲料乳酸含量显著升高，氨态氮/总氮值显著降低，说明在开花期添加乳酸菌能改善青贮饲料的发酵品质，而孕蕾前期的菊芋更适合单独青贮。这可能是由于开花期具有充足的底物，添加乳酸菌后加速对底物的分解，迅速产酸，改善了青贮品质[19]。