实时荧光定量聚合酶链反应法监测慢性髓系白血病外周血 BCR-ABL 融合基因水平的价值研究
2019-03-14陈喜填夏维林郑小玲吴桂香
陈喜填 夏维林 郑小玲 吴桂香
[摘要]目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法监测慢性髓系白血病（CML）外周血 BCR-ABL融合基因水平的价值。方法 选取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例，应用qRT-PCR法检测患者的BCR-ABL融合基因水平，并监测不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平，动态监测不同BCR-ABL融合基因水平组患者伊马替尼的治疗效果及无病生存期（DFS），患者治疗前后的BCR-ABL转录水平变化。结果 急变期患者的BCR-ABL转录本水平明显高于加速期和慢性期，加速期患者的BCR-ABL转录本水平明显高于慢性期，组间两两比较差异均有统计学意义（F=4.68，P=0.00）。疗效满意方面：低水平组与中水平组患者比较，差异无统计学意义（P>0.05），但两组均明显高于高水平组，差异有统计学意义（P<0.05）;中位DFS方面：BCR-ABL融合基因低水平组患者的中位DFS明显长于中水平组、高水平组，中水平组的中位DFS明显长于高水平组，组间两两比较差异均有统计学意义（F=36.15，P=0.00）。伊马替尼靶向治疗第3、6、12个月后的BCR-ABL转录本水平均明显低于治疗前（P=0.00）;通过伊马替尼靶向治疗，患者的BCR-ABL转录本平明显降低，但前6个月的下降幅度最明显。结论 qRT-PCR技术可准确地监测患者外周血BCR-ABL融合基因水平，有利于辅助CML患者疾病的诊断和病情分期，同时，通过对CML患者不同时期外周血BCR-ABL 融合基因水平的动态监测有利于准确评估患者的治疗效果和预后，对CML患者治疗方案的选择具有重要指导意义。
[关键词]实时荧光定量聚合酶链反应;慢性髓系白血病;外周血;BCR-ABL融合基因
[中图分类号] R733.72 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）1（a）-0011-05
慢性髓系白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）是临床常见的造血干细胞恶性肿瘤疾病，其发病机制为22号染色体的长臂与9号染色体的短臂相互易位t（9;22）（q34;q11）形成特征性Ph染色体，分子水平表现为BCR-ABL融合基因形成，并通过BCR-ABL蛋白导致CML发病。CML起病缓慢，其病程可分为无症状期、慢性期（chronic phase，CP）、加速期（accelerated phase，AP）和急变期（blastic phase，BP），随着病情发展，患者可出现脾大、发热、贫血、出血、胸骨压痛等临床症状[1-3]。目前，CML的临床治疗中，靶向药物治疗得到快速发展，显著提高了CML患者的临床疗效，延长了其无病生存期（disease free survival，DFS），其中，选择性酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼通过与 BCR-ABL激酶上的 ATP位点竞争性结合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物磷酸化水平，从而特异性地抑制 BCR-ABL阳性细胞的增生并诱导其凋亡，从而发挥治疗作用。但近年来，CML患者对伊马替尼出现耐药性的报道不断增多，部分CML患者BCR-ABL融合基因水平再度升高，并出现加速或急变为急性白血病而死亡[4-5]。积极监测CML患者的病情变化，及时调整治疗方案，降低患者耐药性和肿瘤的复发成为临床关注的焦点。故动态监测 BCR-ABL 融合基因水平对 CML 的疗效及预后的判断尤为重要。临床研究显示[6-9]，CML患者外周血BCR-ABL融合基因水平与患者不同疾病分期具有显著相关性，提示可以通过患者外周血BCR-ABL融合基因水平监测其病情的进展和变化，但目前国内而关于CML患者外周血 BCR/ABL 融合基因水平在监测CML疾病进展情况方面的应用较少报道，且尚需临床数据加以验证。我院自2010年开始，已经开展包括 BCR-ABL 融合基因在内等白血病相关项目的检测，目前BCR-ABL融合基因水平的监测采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法，结果准确可靠。本研究就qRT-PCR法监测慢性髓系白血病外周血BCR-ABL融合基因水平的临床价值展开研究，旨在为临床提供参考。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例。纳入标准：①入院经骨髓细胞形态学、染色体核型分析以及融合基因检测等确诊为CML，参照2016年版《NCCN白血病防治指南》相关诊断标准[7];②既往未进行相关化疗、靶向药物治疗;③预计生存期>12个月;④患者对本研究内容知情并自愿参加。排除标准：①诊断类型白血病的患者;②合并严重的心、脑、肝、肾等实质性器官疾病的患者;③对本研究药物过敏者;④机体状况较差，不耐受化疗、靶向治疗的患者。本研究经我院医学伦理委员会批准进行。35例患者中，男21例，女14例;年龄17～74岁，平均（48.62±6.15）歲;疾病分期：慢性期29例，加速期4例，急变期2例。根据患者外周血BCR-ABL融合基因水平将患者分为低水平组（BCR-ABL≤10.00%）共11例，中水平组（10.00%
1.2方法
所有患者均于我院进行伊马替尼靶向药物治疗，并借助武汉康圣达检验中心检测患者BCR-ABL融合基因水平，分别于治疗前、治疗后第3、6、12个月各检测1次患者外周血BCR-ABL融合基因水平。患者出院后进行密切随访，记录患者疾病复发或死亡时间。
1.2.1仪器与试剂 qRT-PCR仪采用美国伯乐CFX96，细胞裂解液采用TRhol试剂（美国Invitrogen公司），白细胞分离液采用人淋巴细胞分离液（天津美德太平洋科技有限公司），融合基因定量检测试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司。
1.2.2检测方法与步骤 采用qRT-PCR法检测患者的BCR -ABL转录本水平，具体步骤如下。①RNA提取：抽取患者空腹静脉血5 ml置于EDTAK2抗凝管中，混匀，加入人淋巴细胞分离液分离白细胞，加入TRhol试剂裂解白细胞，经氯仿萃取出核酸，并利用异丙醇沉淀提取RNA。②RT-PCR反应：将RNA反应管、DEPC-H20反应管、对照品和标准品反应管置于qRT-PCR仪中进行扩增，循环参数：45℃，20 min;95℃，5 min;95℃，15 s;58℃，60 s;循环45次。设立阳性对照和阴性对照，内参基采用ABL。③计算标准曲线：利用标准品qRT-PCR反应扩增的结果制作出标准曲线。④计算样本BCR-ABL水平：通过样本Ct值和标准曲线计算出样本起始BCR-ABL值和ABL值，选取ABL≤38的样本，根据以下公式计算BCR-ABL水平。BCR-ABL（%）=（BCR-ABL拷贝数/ ABL拷贝数）×100%。上述各项操作和步骤均按照仪器和试剂盒说明严格规范操作。
1.3观察指标
①不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平;②不同BCR -ABL融合基因水平组患者伊马替尼的治疗效果及预后;③患者治疗前后的BCR-ABL转录水平变化。
1.4疗效标准
根据患者治疗后血象各项指标变化、Ph+细胞水平以及BCR-ABL水平将患者的临床疗效分为以下几点。①血液学缓解（complete hematologic remission，CHR）：外周血白细胞（white bloodcell，WBC）≤10×109/L，WBC分类正常，血小板<450×109/L，无髓外白血病浸润，无幼稚粒细胞，维持4周;②部分细胞遗传学缓解（partial cytogenetic remission，PCyR）：Ph+细胞≤35%和（或）BCR-ABL≤10%;③完全细胞遗传学缓解（complete cytogenetic response，CCyR）：少检查20个核分裂象，Ph+细胞为0和（或）BCR-ABL<1%;④分子学缓解（major molecular response，MMR）：BCR-ABL<0.1%。评定标准参照参照中国2013年版CML治疗指南。
疗效满意为3个月达到CHR和PCyR，6个月达到CCyR，12个月达到MMR;疗效警告为3个月BCR-ABL>10%和（或）Ph+细胞36%～95%，6个月BCR-ABL 1%～10%和（或）Ph+细胞1%～35%，12个月BCR-ABL为0.1%～1%;治疗失败为3个月未达到CHR和（或）Ph+细胞100%，6个月Ph+细胞>35%和（或）BCR-ABL>10%，12个月Ph+细胞≥1%和（或）BCR-ABL>1%。
1.5统计学方法
采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验和方差分析;计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平的比较
急变期患者的BCR-ABL转录本平为（97.93±2.16）%，明显高于加速期的（86.35±5.37）%和慢性期的（30.28±15.92）%，加速期患者的BCR-ABL转录本平明显高于慢性期，组间两两比较差异均有统计学意义（F=4.68，P=0.00）。
2.2不同BCR-ABL融合基因水平组患者伊马替尼治疗效果及预后的比较
疗效满意方面：低水平组与中水平组患者比较，差异无统计学意义（P>0.05），但两组均明显高于高水平组，差异均有统计学意义（P<0.05）;中位DFS方面：低水平组患者的中位DFS明显长于中水平组、高水平组，中水平组的DFS明显长于高水平组，组间两两比较差异均有统计学意义（F=36.15，P=0.00）;三组患者中共有5例患者在伊马替尼治疗第3个月后无法达到CHR，通过改用其他合适的治疗方案治疗第12个月后，4例患者达到MMR（表1）。
2.3 CML患者治疗前后BCR-ABL融合基因水平的比较
伊马替尼靶向治疗前患者的BCR-ABL融合基因平均水平为（88.464±21.567）%，治疗后第3、6、12个月分别为（9.673±3.257）%、（2.482±0.716）%、（0.043±0.002）%;治疗后第3、6、12个月的BCR-ABL融合基因水平均明显低于治疗前（P=0.00）;通过伊马替尼靶向治疗，患者的BCR-ABL转录本平明显降低，但前6个月的下降幅度最明显（图1）。
3讨论
CML起源于多能干细胞的髓系恶性增生，患者22号染色体的长臂与9号染色体的短臂发生相互易位，形成特征性Ph染色体，从而产生BCR-ABL融合基因，主要为b3a2和b2a2两种转录本形式。研究显示[10-12]，95%以上的CML患者为BCR-ABL阳性，BCR-ABL融合基因通過转录BCR-ABL蛋白，可持续激活并增强胞质多种酪氨酸激酶的活性，从而扰乱了细胞内正常的信号传导途径，并启动细胞增殖和生存的信号联级反应，抑制细胞凋亡的发生。因此，BCR-ABL融合基因的水平对CML患者病情的发展具有重要影响， 在CML患者疾病分期、疗效评价、病情预后判断等方面具有重要意义[13-14]。
qRT-PCR技术是在传统PCR反应体系中加入荧光化学物质，并通过荧光信号实时监测整个PCR进程和产物总量，最后通过标准曲线对待测样品的模版进行定量分析的方法。与传统PCR技术相比具有如下优势[15-18]：①通过荧光信号强度的检测可以记录每次循环扩增产物的总量，有效解决了传统PCR只能终点进行定量检查的局限;②Ct值的重现性好，Ct值一般设定在PCR反应刚进入指数扩增期，此时微小误差尚未放大，得到的Ct值较为恒定;③模板的Ct值与起始模板的拷贝数存在线性关系，通过标准曲线可对样品进行准确定量测定。
RT-PCR于1988年首次应用于CML的BCR-ABL融合基因水平检测，其准确性得到临床广泛认可，我院自2010年已经开展包括BCR-ABL融合基因在内等白血病相关项目的检测，目前BCR-ABL融合基因水平的监测采用qRT-PCR法，结果准确可靠[19-20]。本研究采用qRT-PCR法对35例CML患者BCR-ABL融合基因进行检测，结果显示，从慢性期到急变期，患者的BCR-ABL转录本平不断升高，可见BCR-ABL融合基因水平与CML患者病情的程度具有明显相关性，BCR-ABL融合基因水平越高，患者的病情越重，因此BCR-ABL水平在CML诊断和疾病分期中具有较高的准确性。通过伊马替尼治疗后，不同BCR-ABL水平组患者的疗效和临床预后具有明显差异，其中低水平组和中水平组患者的疗效满意率较高，患者的DFS更长，而高水平组患者的疗效满意率底，DFS较短，由此可见，BCR-ABL水平与患者的临床疗效和预后具有明显相关性，可有效指导患者治疗方案的选择、评估患者的治疗效果以及预测患者的预后情况。通过动态监测患者治疗前、治疗后第3、6、12个月的外周血BCR-ABL融合基因水平，結果显示，经过伊马替尼靶向治疗后第6个月，患者BCR-ABL转录本水平明显低于治疗前，其下降幅度前6个月最为显著（P<0.05）;本研究中5例患者在伊马替尼治疗后第3个月后仍然无法达到CHR，BCR-ABL转录本水平>10.00%，通过检测其BCR-ABL突变情况，改用合适的酪氨酸激酶抑制剂治疗12个月后，4例患者达到MMR。因此，在利用伊马替尼治疗CML患者过程中，可通过动态监测患者外周血BCR-ABL融合基因水平，发现患者治疗第3个月以后，若其BCR-ABL转录本水平≤10.00%，或治疗第12个月时BCR-ABL转录本水平≤1.00%，此时可维持当前伊马替尼剂量，否则，应增加剂量或改用其他合适的酪氨酸激酶抑制，从而更有效地实现CML患者不同时期的精准治疗，提高患者的长期无病生存率。
本研究不足之处：本研究样本数较少，仅35例，实验数据可能存在较大误差，有待进一步扩大样本数量，以缩小实验误差。
综上所述，qRT-PCR技术可准确监测患者外周血BCR-ABL融合基因水平，有利于辅助CML患者疾病的诊断和病情分期，在CML的临床治疗中，通过对CML患者动态监测CML患者外周血BCR-ABL融合基因水平可及时、准确地评估患者的临床疗效，及时发现其病情变化并调整其治疗方案，对实现CML患者不同时期的精准治疗、提高其DFS具有重要作用。
[参考文献]
[1]中华医学会血液学分会.中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南（2016年版）[J].中华血液学杂志，2016，37（8）：633-639.
[2]Kurita D，Hatta Y，Hojo A，et al.Adult acute lymphoblastic leukemia with a rare b3a3 type BCR/ABL1 fusion transcript[J].Cancer Genet，2016，209（4）：161-165.
[3]陈曦希，杨明珍，夏瑞祥.调节性T细胞及相关细胞因子在慢性髓系白血病中的变化[J].安徽医科大学学报，2016， 51（7）：1015-1018.
[4]Tong YQ，Zhao ZJ，Liu B，et al.New rapid method to detect BCR-ABL fusion genes with multiplex RT-qPCR in one-tube at a time[J].Leuk Res，2018，1（8）：69.
[5]张江召，赵哲，黎纬明，等.国产伊马替尼与原研伊马替尼治疗初诊慢性髓性白血病慢性期的临床疗效及用药安全性对比分析[J].临床血液学杂志，2017，5（4）：527-531.
[6]Duan MH，Li H，Cai H.A rare e13a3 （b2a3） BCR-ABL1 fusion transcript with normal karyotype in chronic myeloid leukemia： The challenges in diagnosis and monitoring minimal residual disease （MRD）[J].Leuk Res，2017，8（22）：8.
[7]徐俊卿，徐泽锋，王静雅，等.615例Ph染色体/BCR-ABL融合基因阴性骨髓增殖性肿瘤患者的症状负荷评估[J].中华血液学杂志，2016，37（1）：26-29.
[8]许大兵，孙余婕，沈佐君.CML患者TGF-β1mRNA与bcr/ablP210融合基因转录本表达的关系[J].检验医学，2016， 31（8）：671-674.
[9]Manthawornsiri Y，Polpanich D，Yamkamon V，et al.Magnetic Nanoparticles PCR Enzyme-Linked Gene Assay for Quantitative Detection of BCR/ABL Fusion Gene in Chronic Myelogenous Leukemia[J].J Clin Lab Anal，2016，30（5）：534-542.
[10]庞丽，权文强，吴军录，等.TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测RIG-G基因方法的建立及其方法学验证[J].中华检验医学杂志，2016，39（12）：936-935.
[11]吴薇，韩瑞玲，张力，等.RQ-PCR在慢性粒细胞白血病细胞BCR-ABL融合基因检测中的应用[J].检验医学与临床，2016，13（22）：3133-3134.
