新风胶囊通过调控凋亡相关蛋白促进类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞凋亡

刘健 章平衡 曹永贺

【摘 要】目的：探讨新风胶囊（XFC）对类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞凋亡的影响。方法：采用随机、双盲法将28例活动期类风湿关节炎患者分为XFC组15例和来氟米特组（LEF组）13例，采用流式细胞术分析CD4+ T细胞凋亡水平，Western blot法和实时定量PCR检测凋亡相关蛋白及mRNA相对表达水平。结果：与治疗前比较，治疗后XFC组外周血红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体、DAS28、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）mRNA水平明显降低（P < 0.01 ），而CD4+T细胞凋亡水平、Fas mRNA、FasL mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA、Bax mRNA和Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白水平明显升高（P < 0.01）;与LEF组比较，XFC组ESR、CRP、Bcl-2 mRNA表达水平明显降低（P < 0.01），CD4+T细胞凋亡水平、Fas mRNA、FasL mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA、Bax mRNA和Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：XFC通过上调Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3促凋亡蛋白表达，下调Bcl-2抑制凋亡蛋白表达，促进异常活化的CD4+T细胞凋亡，从而抑制类风湿关节炎患者机体的免疫炎症反应改善病情。

【关键词】 关节炎，类风湿;新风胶囊;凋亡;CD4+T细胞

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以全身关节滑膜炎症及增生为主要病理改变的慢性自身免疫性疾病[1]。目前有研究认为，RA关节滑膜的增生及炎症反应与其体内CD4+T细胞的凋亡减少密切相关[2-4]。CD4+T细胞作为一种标志性炎性细胞能够浸润于RA的全身各个组织中[5-6]。在一些刺激因素的作用下，CD4+T细胞的增生与凋亡动态平衡被打破，使其凋亡率减少，从而大量增生的CD4+T细胞释放大量炎性细胞因子，作用于各个组织器官均可发生炎症反应。目前有少量研究报道，在RA患者各组织的CD4+T细胞中检测出异常表达的凋亡相关基因或蛋白（如p53、Fas、FasL、Bcl-2、Caspase-8等）[7]。新风胶囊（XFC）是安徽中医药大学第一附属医院研制的应用于临床治疗风湿病的中药复方。前期研究发现，其对RA的疗效明显，并能改善RA患者的关节症状，降低其炎症反应，提高患者生活质量等[8]。本文主要观察XFC对RA外周血CD4+T细胞凋亡率的影响及凋亡相关指标的变化，探讨XFC调控RA外周血CD4+T细胞凋亡的可能分子机制。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2013年7月至2014年5月在安徽中医药大学第一附属医院风湿科就诊的门诊及住院RA患者28例，采用随机对照、双盲法分为XFC组15例和来氟米特组（LEF组）13例。

2组患者基本资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性，见表1。本研究经安徽省中医院伦理委员会批准（批号2012AH-038-01）。

1.2 诊断标准 参照1987年美国风湿病学会（ACR）制定的RA诊断标准[1]。

1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准;②年龄18～66岁;③患者签属知情同意书;④如服用非甾体抗炎药（NSAIDs），则剂量至少已稳定4周，如未服用，则至少已1周未服;如果使用LEF，则至少已经接受LEF 3个月治疗，且剂量稳定在10 mg·d-1至少已4周，且未合用其他改善病情抗风湿药（DMARDs）;如果口服糖皮质激素，则剂量（相当于醋酸泼尼松的量）必须≤15 mg·d-1至少已4周。

1.4 排除标准 ①4周内使用过肌肉注射或静脉滴注糖皮质激素;②DAS28-3评分 > 5.1分（高活动性）者;③重叠其他风湿病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、严重的膝骨关节炎等患者;④合并心血管、脑、肺、肝、肾和造血系统等严重疾病或近期有严重感染者;⑤妊娠或哺乳期妇女，及精神病患者;⑥白细胞 < 3.5×109·L-1、血小板 < 90×109·L-1、血色素 < 8.5 g·dL-1者;⑦胃十二指肠溃疡、胃炎活动期或长期服用非甾体抗炎药导致胃病者;⑧对试验药物过敏者;⑨1个月内参加过其他临床试验者。

2 方 法

2.1 治疗方法 XFC组口服XFC（安徽中医药大学第一附属医院制剂，皖药制字Z20050062，规格0.4 g），每次3粒，每日3次;LEF胶囊（模拟剂），每次10 mg，每晚1次。LEF组口服LEF胶囊（福建江天生物药业有限公司，生产批号H20050175，规格10 mg），每次10 mg，每晚1次;XFC（模拟剂），每日3次，每次3粒。2组均治疗120 d。

2.2 实验方法

2.2.1 CD4+T细胞的分离与纯化 取RA患者抗凝静脉血10 mL，用1∶1 PBS稀释后缓慢倒入5 mL淋巴细胞分离液中;在离心机中以25 ℃、1800 r·min-1离心20 min;离心后取白色云雾层单个核细胞置于无菌离心管中;加入PBS混匀，离心机以4 ℃、1200 r·min-1离心10 min，洗涤2次后调整细胞数为1×107·mL-1。然后加入CD4-FITC20 μL标记，避光孵育30 min;流式细胞分选仪进行目的细胞的分选纯化。

2.2.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色结合流式细胞术检测CD4+T细胞凋亡 取100 μL新鲜RA患者静脉血于抗凝管中。然后离心机以1500 r·min-1离心5 min。丢弃上清，加入PBS适量再置离心机中以1500 r·min-1离心5 min，如此循坏2次。然后，加入10 μL PerCP-Cy5.5-CD4混匀，避光孵育30 min。然后加入400 μL 1×AnnexinⅤ结合液和5 μL AnnexinⅤ-FITC染色液，混匀，避光孵育15 min。再加入10 μL PI染色液，避光孵育5 min。

流式细胞术检测CD4+T细胞凋亡水平。

2.2.3 RT-PCR检测细胞凋亡相关基因表达 将TRIzol 1 mL加入提取的RA患者外周血CD4+T细胞中，吹打混匀待裂解后，加入200 μL三氯甲烷，振荡10 s后，静置3 min。随后置离心机以4 ℃，12000 r·min-1离心15 min，提取500 μL上清于无RNA酶的离心管中。然后加入等量异丙醇，静置10 min后离心机以4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，留取底部沉淀物。加入1 mL质量分数为75%的乙醇（DEPC水配制），于离心机以4 ℃，12 000 r·min-1离心5 min，弃上清，室温干燥5 min。最后，加入30 μLDEPC水，-80 ℃冰箱保存备用。按照逆转录试剂盒进行逆转录。反应体系如下：2×SYBR Green mixture 5 μL;cDNA 1 μL;Forward primer1 μL;Reverseprimer 1 μL;双蒸水2 μL;反应总体积为10 μL。反应条件如下：95 ℃ 5 min，（95 ℃10 s、60 ℃ 30 s）×40个循环。各指标引物见表2。

2.2.4 Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达 加入1 mL RIPA细胞裂解液于分离提取的CD4+T细胞中裂解30 min。然后离心机以12 000 r·min-1离心10 min。取上层蛋白液，加入等量的2×SDS-PAGE缓冲液，沸水浴10 min，充分变性。然后转膜、封闭。随后，分别加抗FasL抗体（1∶400）、抗Fas抗体（1∶400）、抗Caspase-8抗体（1∶800），抗Caspase-3抗体（1∶800）、抗β-actin抗体（1∶800），4 ℃孵育过夜;随后，Tris-HCL缓冲液洗涤3次，每次10 min，加二抗IgG（H + L）（1∶10 000）封闭2 h;TBST洗涤3次，每次10 min。ECL发光试剂显色，用Image J软件对条带进行分析比较。

2.3 观察指标 检测患者治疗前后红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体、6-磷酸葡萄糖异构酶（GPI）的变化，在安徽中医药大学第一附属医院实验室完成。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验;等级资料采用Wilcoxon秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 2组患者治疗前后免疫炎症指标比较 治疗后，XFC组外周血ESR、CRP、CCP、DAS28水平较治疗前明显降低（P < 0.01），LEF组ESR、CRP、DAS28水平较治疗前明显降低（P < 0.01）;与LEF组比较，XFC组ESR、CRP水平明显降低（P < 0.01）。见表3。

3.2 2组患者外周血CD4+T细胞凋亡率比较 治疗后，XFC组、LEF组CD4+ T细胞凋亡率较治疗前明显升高（P < 0.01）;与LEF组比较，XFC组CD4+T细胞凋亡率差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。流式细胞术检测的CD4+T细胞凋亡水平的变化。

3.3 2组RA患者外周血CD4+T细胞凋亡相关蛋白表达水平比较 治疗后， XFC组和LEF组RA患者外周血中CD4+T细胞凋亡蛋白Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3表达水平较治疗前明显升高（P < 0.01）;与LEF组比较，XFC组凋亡蛋白Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见表5。凋亡蛋白表达情况电泳图。

3.4 2组RA患者外周血CD4+T细胞凋亡相关基因相对表达量比较 治疗后，XFC组和LEF组CD4+T细胞凋亡基因Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、Bax表达水平较治疗前明显升高（P < 0.01），Bcl-2表达水平较治疗前明显降低（P < 0.01）;与LEF组比较，XFC组Bcl-2表达水平明显降低（P < 0.01），而Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、Bax表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表6。qRT-PCR测定各凋亡基因的溶解曲线。

4 讨 论

RA是一种自身免疫性疾病，疾病发生发展过程中伴随着机体T、B、Treg淋巴细胞等免疫细胞水平的失衡，从而导致机体免疫炎症的发生[9]。RA免疫细胞水平的失衡主要归结于多种因素的刺激导致机体T、B、Treg淋巴细胞等免疫细胞的增殖和凋亡动态的失衡[10]。其中T淋巴细胞具有促进免疫功能，加重自身免疫反应，而Treg细胞则具有免疫耐受、抑制免疫的功能。RA患者自身免疫功能的紊乱主要是T淋巴细胞功能的亢进和Treg细胞功能低下所致。另外，目前国内外均有研究观察到RA机体中多种细胞的凋亡存在异常，如单核细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等[11-14]。目前有研究发现，RA患者体内CD4+T细胞的增殖率明显升高，且凋亡基因的表达与疾病活动度、关节症状体征及炎症性指标（ESR、CRP）及免疫指标（RF、抗CCP抗体、IgG）均有明显相关性，说明CD4+T细胞的凋亡异常会导致体内致炎因子大量分泌，免疫炎症加重，促进RA疾病的发展及疾病活动[15]。

细胞凋亡是由基因控制的一种程序性细胞死亡的生物学行为，它是机体维持稳定的生长发育的重要生物学过程。细胞凋亡异常与多种自身免疫性疾病的发病过程密切相关，如RA、肿瘤等疾病。Ⅰ型跨膜蛋白分子Fas是死亡受体家族成员之一，Fas的配体FasL属于神经生长因子超家族成员之一，在活化T淋巴细胞中均能检测出高表达Fas、FasL水平[16]。目前很多研究已证实，FasL与活化的淋巴细胞中的Fas相结合，使Fas/FasL信号通路被激活，从而促进活化淋巴细胞的凋亡，最终实现下调机体过度亢进的免疫反应。另外，Fas-FasL结合后，能够募集胞质中的死亡结构域蛋白（FADD），结合Caspase-8前体结构域中的死亡效应子结构域（DED），随后导致Caspase-8自体活化，從而激活下游的Caspase-3，最终达到细胞凋亡的发生[17]。Bcl-2、Bax是线粒体通路细胞凋亡相关的凋亡蛋白。Bcl-2蛋白是一种抑制凋亡的蛋白，其高表达能够抑制细胞凋亡，促使细胞增殖[18]。Bax蛋白是一种促凋亡蛋白，其水平的升高能促进细胞凋亡[19]。目前有研究发现，RA患者存在促凋亡蛋白Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、Bax的表达水平下降，Bcl-2表达水平升高[20]。另有研究检测RA患者体内CD4+T细胞的凋亡相关蛋白的表达水平，发现Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3明显下降，Bcl-2表达水平升高[21]。

目前对于RA的发病机制尚不明确，故RA的治疗药物种类繁多。XFC是安徽中医药大学第一附属医院自主研制并应用于临床20多年治疗风湿疾病的中药复方。该药有严格的质控标准，临床疗效确切[22]。主要由黄芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣组成，这4味药包含多种有效活性单体，如黄芪多糖、薏苡仁油、雷公藤甲素、雷公藤多苷等，现代药理学研究表明，黄芪多糖具有诱导宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞凋亡的作用[23]。薏苡仁油能够通过诱导线粒体膜倒塌和去极化，从而促进乳腺癌细胞的凋亡[24]。雷公藤甲素对体外培养的RA患者滑膜成纤维细胞具有抑制增殖作用，并能够促进其凋亡[25]。

雷公藤多苷则能够诱导RA患者外周血中的单核细胞发生凋亡。并且在前期的临床研究中发现，XFC不仅能够改善RA患者的症状体征，提高患者生活质量，还能够抑制血小板活化[26]，促进脂代谢[27]，调控细胞因子网络平衡，改善患者氧化应激状态[28]等。本研究通过检测XFC对RA患者外周血CD4+T细胞凋亡率及相关凋亡基因和蛋白，发现XFC治疗后RA患者外周血CD4+T细胞凋亡水平明显增加，与LEF组比较，差异无统计学意义

（P > 0.05）。并且XFC治疗后Fas mRNA、FasL mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA和Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白水平明显升高，Bcl-2 mRNA表达水平下降。与LEF组治疗后比较，XFC组Bcl-2mRNA表达水平明显降低。同时本研究检测了RA患者体内免疫炎症指标的水平，发现治療后XFC组外周血ESR、CRP、CCP水平明显降低，与LEF组比较，XFC组ESR、CRP水平降低更明显。上述均说明XFC能够上调Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3促凋亡蛋白水平，并且下调Bcl-2抑制凋亡蛋白水平，促进异常活化的CD4+T细胞凋亡，从而改善RA患者机体的免疫炎症。

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