β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶对速溶绿茶粉水溶液香气的影响

方 可 ，李 婷 ，朱艳冰 ，2，3，黄高凌 ，2，3，杨远帆 ，2，3，倪 辉 *，2，3

（1.集美大学 食品与生物工程学院，福建 厦门361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021）

速溶茶粉是以成品茶叶为原料，经水提取、浓缩、干燥等工艺加工而成的可溶性粉状物质[1]，它是重要的茶叶深加工产品，是加工茶饮料、茶糕点等食品的原料。依据原料茶叶的不同，速溶茶一般可分为速溶红茶、速溶绿茶、速溶乌龙茶、速溶白茶、速溶黄茶、速溶黑茶、速溶花茶、速溶调配茶等[2]。在速溶茶粉提取生产过程中，由于原料茶叶香气成分的挥发及降解和氧化[3]，导致速溶茶粉及其加工产品的香气远远不如原料茶叶。人们先后研究了多种改良速溶茶粉质量的技术，如膜分离技术、低温浓缩技术、香气回填技术等[4-5]。此外，人们发现茶叶产品中含有香气前体，在酶的作用下可释放出香气成分，该方法具有特异性，对其他品质成分影响小[6]；因此，酶工程技术是改良速溶茶粉及其加工产品（茶饮料）风味的重点研究领域。

相关研究表明，茶叶中的香气前体主要是糖苷类物种，包括单糖苷和二糖苷[7]。β-葡萄糖苷酶（βglucosidase，EC 3.2.1.21）和 α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是两种重要的糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶水解结合于非还原性末端的β-D-葡萄糖苷键[8]；α-L-鼠李糖苷酶水解末端α-L-鼠李糖苷键[9]。近年来，人们发现黑曲霉胞外粗酶可提高速溶茶粉水溶液及茶饮料香气物质含量[10-11]，并研究了β-葡萄糖苷酶对茶饮料香气的影响[12]，但尚未系统研究β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶以及这两种酶的协同作用对速溶茶粉水溶液及茶饮料等产品香气的影响。

针对以上研究现状，以我国产量最大的速溶茶粉--速溶绿茶粉为原料，分别用β-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶以及混合酶对速溶绿茶粉水溶液进行处理，综合运用GC-MS、感官评价和风味强度值（OAV）分析等方法评价香气特征变化，旨在阐明β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶对速溶绿茶粉水溶液香气的改良效果，为提高速溶茶粉加工产品的风味提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

喷干型速溶绿茶粉：购于大闽（漳州）食品有限公司；β-葡萄糖苷酶：购于上海源叶生物科技有限公司；黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶：作者所在实验室按照表达纯化制备得到。环己酮、正构烷烃（C8-20）、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、N-乙基吡啶、芳樟醇、壬醛、癸醛、反式-β-罗勒烯、α-萜品烯、萜品油烯、γ-萜品烯、2-庚酮、α-蒎烯、莰烯、β-香叶烯、水芹烯、2-壬酮、α-法尼烯：购于美国Sigma公司；香叶醇、苯甲醛、藏花醛、顺式-3-己烯醇、水杨酸甲酯、2-甲基丁酸己酯、伞花烃、柠檬烯、反式-β-罗勒烯、己醇：购于英国Alfa Aesar公司。

1.2 主要仪器

手动 SPME进样器和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司产品；Rtx-5MS色谱柱：美国Restek公司产品；QP 2010气相色谱-质谱联用仪 （GC-MS）：成都岛津仪器设备有限公司（成都）产品；RO-03A制冰机：日欧制冷设备有限公司（深圳）产品；GZX-DH电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械厂（上海）产品。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备 速溶绿茶粉水溶液 （IGT）：称取3 g速溶绿茶粉于60 mL顶空瓶中，加入30 mL纯水，在40℃水浴锅中保温；β-葡萄糖苷酶处理后的速溶绿茶粉水溶液（GIGT）：称取3 g速溶绿茶粉于60 mL顶空瓶中，加入30 mL纯水和β-葡萄糖苷酶（10 U），在40℃水浴锅中保温；α-L-鼠李糖苷酶处理后速溶绿茶粉水溶液（LIGT）：称取3 g速溶绿茶粉于60 mL顶空瓶中，加入30 mL纯水和α-L-鼠李糖苷酶（13 U），在40℃水浴锅中保温；β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶混合酶处理后的速溶绿茶粉水溶液（GLIGT）：称取3 g速溶绿茶粉于60 mL顶空瓶中，加入30 mL纯水和β-葡萄糖苷酶（10 U）、α-L-鼠李糖苷酶（13 U），在 40 ℃水浴锅中保温。

1.3.2 样品气味特征的感官评价 根据ISO 8589标准和相关文献方法对各样品的青草香、花香、甜香、木香和焦糖香进行感官评价[11，14]。

1.3.3 样品中挥发性化合物的分析 样品在40℃水浴锅中用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头吸附20 min后进行固相微萃取顶空进样分析，解吸附时间为3 min，GC-MS分析条件参考文献[13]。通过特征离子峰和保留指数与标准品、挥发性化合物谱库（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）以及参考文献进行对照后定性。其中，保留指数 （RIx）借鉴Kratz和Vandendoo[14]方法进行运算。对于2-甲基呋喃和顺式-3-己烯醇等27种具有对照标准品的成分，根据它们的标准曲线采用外标法进行定量；其余10种没有购买到对照标准品的成分通过内标环己酮标准曲线采用SIM模式（特征碎片为55）进行相对定量分析。

1.3.4 挥发性成分香气强度值的计算 香气强度值（OAV）采用挥发性成分浓度除以该成分气味阈值的方式计算。

1.4 数据统计方法

通过Excell 2013（微软，美国）计算平均值。采用SPSS-IBM 19.0（IBM，美国）软件进行显著性分析和主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 酶处理对香气感官特征的影响

如图1所示，IGT以焦糖香和甜香为主，木香、花香及青草香较弱，此结果与相关研究报道的绿茶香气特征（主要呈现青草香）不一致[15]，其原因是速溶茶粉加工过程中香气成分发生了挥发、氧化及美拉德反应[3]。相比IGT，GIGT的青草香及花香显著增强，焦糖香显著降低，整体香味以青草香、花香、甜香为主；LIGT与IGT相比，焦糖香显著降低，但其他香气感官强度没有显著变化，整体香气以焦糖香和甜香为主；GLIGT的焦糖香是所有样品中最低的，且青草香和花香是所有样品中最强的，其整体风味呈现出浓郁青草香和甜香以及显著的花香。对酶处理前后速溶绿茶粉水溶液花香、青草香、甜香、木香和焦糖香进行主成分分析，其结果如图2所示。其中，主成分1（PC 1）代表63.86%的总变量值，其与甜香、花香、青草香和木香的感官强度数值呈正相关，而与焦糖香感官强度值呈现负相关（图2（a））。主成分2（PC 2）与木香、花香和焦糖香的感官评价数值呈现正相关，与甜香和青草香数值呈现负相关，可解释16.96%的总变量（图2（a））。主成分散点图显示4种样品的香气特征可归为两类（图2（b）），其中IGT与LIGT同属一类，GIGT与GLIGT同属一类，此结果表明，β-葡萄糖苷酶处理会导致速溶绿茶粉水溶液的整体香气特征显著变化，可将速溶绿茶粉水溶液的香气由焦糖香为主转变成以青草香和甜香为主。Zhu等人研究表明黑曲霉胞外酶处理速溶绿茶粉水溶液，可增强花香和发酵香，同时减弱青草香、木香和甜香减弱[10]；Ni等人研究发现用黑曲霉胞外酶处理绿茶水溶液，其烘烤香和蘑菇香增强，同时青草香、焦糖香和木香减弱[13]。这些相关研究与本研究结果显著不同，其原因是相关研究采用的黑曲霉胞外粗酶液的的酶种类复杂，而作者采用了纯化的β-葡萄糖苷酶及α-L-鼠李糖苷酶。

图1 IGT、GIGT、LIGT和GLIGT感官评价雷达图Fig.1 Radar map of the sensory evaluations of IGT、GIGT、LIGT and GLIGT

图2 感官评价的主成分及得分散点图Fig.2 Principal components and scatter plot of sensory evaluation scores

2.2 酶处理对挥发性成分组成的影响

采用GC-MS对速溶绿茶粉水溶液及其不同酶处理样品中的挥发性物质进行分析，得到总离子流图（图3），依据相似度检索、特征离子碎片分析和标准品比对等方法进行定性分析，共鉴定出37种挥发性成分（表1）。这些化合物包括3种呋喃类物质、6种醛类物质、4种醇类物质、3种酯类物质、3种酮类物质、14种烯烃类物质和4种其它物质。

定量分析结果（表2）显示，IGT的主要挥发性化合物为 3-甲基丁醛 （354.66 μg/L）、2-甲基丁醛（583.44 μg/L）、壬醛（219.46 μg/L）、2-乙基己基水杨酸（411.64 μg/L）、N-吡啶（994.08 μg/L）、2，6-二叔丁基对苯酚（2 135.05 μg/L），此结果与 Qin等人[16]报道的中国绿茶的主要挥发性化合物是正戊醛、正己醛、柠檬烯、苯甲醛、壬醛、α-萜品醇、水杨酸甲酯、香叶醇和橙花叔醇的结果以及Wu等人[17]报道的武夷绿茶特征香气成分为芳樟醇、香叶醇、顺式-茉莉酮、δ-杜松烯、依兰烯、α-雪松烯和β-石竹烯的结果不成一致，主要原因是速溶茶粉在加工过程中发生氧化、缩合、聚合和基团转移等反应[1，18]。

GIGT中共检测出37种挥发性化合物，主要为2-甲基丁醛（404.52 μg/L）、壬醛（254.94 μg/L）、顺式-3-己烯醇（3 443.81 μg/L）、香叶醇（1 803.23 μg/L）、δ-杜松烯 （392.11 μg/L）、α-去二氢菖蒲烯（4 10.61 μg/L）、2-乙基己基水杨酸 （577.69 μg/L）、2，6-二叔丁基对苯酚（3 673.16 μg/L）（表 2）。相比IGT中的挥发性化合物，GIGT中顺式-3-己烯醇（0.00 vs 3 443.81 μg/L）、 香叶醇 （0.00 vs 1 803.23 μg/L）、 己醇 （ 0.00 vs 124.68 μg/L）、 水杨酸甲酯（0.00 vs 134.25 μg/L）、苯甲醛（0.00 vs 104.54 μg/L）、癸醛（0.00 vs 95.77 μg/L）、壬醛、2-十一酮、2-乙基己基水杨酸、α-去二氢菖蒲烯、δ-杜松烯、2，6-二叔丁基对苯酚和3，5-二甲基苯酚的含量显著增加，但3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和N-吡啶的含量显著减少。LIGT中共鉴定出32种挥发性化合物，相对于IGT，其癸醛（0.00 vs 122.05 μg/L）、壬醛（219.46 vs 351.0 μg/L）、2-乙基己基水杨酸 （411.64 vs 674.55 μg/L）等含量显著增加。GLIGT中鉴定出37种挥发性化合物，其主要挥发性化合物与GIGT中一致，但顺式-3-己烯醇（3 443.81 vs 4 017.11 μg/L）、水杨酸甲酯 （134.25 vs 172.66 μg/L）、 壬醛 （254.94 vs 290.6 μg/L）、癸醛（95.77 vs 122.05 μg/L）和 2-十一酮（127.86 vs 256.41 μg/L）、2，6-二叔丁基对苯酚（3 673.16 vs 4 490.56 μg/L）含量进一步提高。以上结果表明，β-葡萄糖苷酶可显著增加速溶绿茶粉水溶液中多种挥发性成分的含量，α-L-鼠李糖苷酶也可以增加一些挥发性成分的含量，且它们对速溶绿茶粉水溶液的挥发性成分的增加存在协同增效作用。

根据相关研究报道，β-葡萄糖苷酶处理可显著增加绿茶汤中顺式-3-己烯醇、水杨酸甲酯和芳香族醇含量[12]；漆酶和α-半乳糖苷酶处理可显著增加绿茶溶液中壬醛含量[19]。作者用β-葡萄糖苷酶处理速溶绿茶粉水溶液，该结果与其他学者相关研究结果相似。此外，本研究发现α-L-鼠李糖苷酶也能增加速溶绿茶粉水溶液的挥发性物质成分，同时α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶在增加速溶绿茶粉挥发性成分方面具有协同增效作用；这两方面的尚未见同类研究报道。

图 3 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT、β-葡萄糖苷酶和 α-L-鼠李糖苷酶挥发性化合物总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram （TIC）of the volatiles in IGT，LIGT，GIGT，GLIGT，β-glucosidase and α-L-rhamnosidase solution

表1 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT中挥发性成分的鉴定及标准曲线Table 1 Identification and standard curves of volatile compounds in IGT、GIGT、LIGT、GLIGT

续表1

表2 IGT、GIGT、LIGT、GLIGT中挥发性化合物定量表Table 2 Quantitative determination of volatile components of IGT、GIGT、LIGT、GLIGT

续表2

2.3 酶处理对挥发性成分气味强度值（OVA）的影响

根据GC-MS检测到的挥发性成分浓度和相关文献报道的气味阈值，计算各成分的OAV值，结果如表3所示。IGT中，3-甲基丁醛（OVA 1773.30）、2-甲基丁 醛 （OVA 583.44）、2-乙 基 呋 喃 （OVA 29.36）、柠檬烯（OVA 4.12）、壬醛（OVA 5.49）等成分的气味强度达到了正常人体嗅觉可以感知的强度（OAV值大于1）。它们分别呈现出可可味、杏仁味、柠檬味和青草香[20-21]，这与IGT主要呈现出焦糖香和甜香相符合。

GIGT 中 3-甲基丁醛（OVA 1193.55）、2-甲基丁醛（OVA 404.52）、2-乙基呋喃（OVA 26.26）、顺式-3-己烯醇（OVA 49.2）、柠檬烯（OVA 4.12）、壬醛（OVA 5.49）、 香叶醇 （OVA 45.05）、 水杨酸甲酯（OVA 3.36）和癸醛（OVA 1.6）的气味强度可被正常人体嗅觉感知（OAV值大于1）（表3）。这些物质分别呈现青草香、花香和甜香，该结果较好解释了GIGT的香气以青草香、花香、甜香为主。LIGT中3-甲 基 丁 醛 （OVA 1290.00）、2- 甲 基 丁 醛 （OVA 493.14）、2-乙基呋喃 （OVA 23.85）、 柠檬烯（OVA 4.17）、壬醛（OVA 8.78）等成分的 OAV 值大于 1，说明这些成分对其整体香气特征具有影响。LIGT与IGT中各成分的OAV值十分相近，说明其主要气味贡献成分与IGT相比没有发生显著变化。GLIGT中3-甲基丁醛 （OAV 1166.90）、2-甲基丁醛（OAV 426.68）、2-乙基呋喃（OAV 23.44）、顺式-3-己烯醇（OAV 57.39）、 柠檬 烯 （OAV 4.22）、 壬醛 （OAV 7.26）、香叶醇（OAV 40.53）、水杨酸甲酯（OAV 4.32）和癸醛（OAV 2.03）成分的OAV值大于1，说明这些成分对其整体香气特征具有影响；该结果与GLIGT显示出很强的青草香、花香和甜香相符合。另外，相对于GIGT来说，GLIGT中具有青草香的挥发性化合物的OAV值明显增加，这就说明α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷在增强速溶绿茶粉水溶液青草香方面具有协同作用。

Ni等人通过GC-O实验发现黑曲霉胞外粗酶可增加绿茶水溶液挥发性成分的气味稀释倍数[13]。本研究发现β-葡萄糖苷酶可提高速溶绿茶粉水溶液青草香和花香成分香气强度值，该结果与Ni等人的研究[13]相似。同时，本研究还发现α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷对速溶绿茶粉水溶液青草香具有协同增强作用，该结果尚未见同类报道。

表3 IGT、GIGT、LIGT和GLIGT的香气强度值Table 3 Odor activity values of IGT、GIGT、LIGT and GLIGT

3 结语

速溶绿茶粉水溶液主要呈现甜香与焦糖香。β-葡萄糖苷酶处理可显著增强速溶绿茶粉水溶液的花香和青草香；α-L-鼠李糖苷酶处理可降低速溶绿茶粉水溶液的焦糖香；β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶对提高速溶绿茶粉水溶液的青草香具有协同增效作用。该研究为利用β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶提高茶饮料、茶糕点等产品的风味提供了基础。