梓树内生解淀粉芽孢杆菌GZ-5发酵条件的优化及其促生作用测定

王 勇，朱洪磊，郭洁心，马 超，张宝俊

（山西农业大学农学院，山西太谷 030801）

应用微生物次级代谢产物来防治植物病害是当前生物防治的主要发展趋势之一[1-4]。植物内生细菌是定殖在健康植物组织内，并与植物建立和谐联合关系的一类微生物，具有促进植物生长、生物固氮、抗病虫害以及增强寄主植物对不良环境条件的适应能力等多种生物学作用[5-6]，尤其是内生拮抗细菌可以产生脂肽、抗菌蛋白等多种物质，是一类重要的生防资源。辛玉成[7]从苹果果实表面分离到1株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XM16，通过试验证明，其对苹果霉心病、枝干病害等植物真菌病害有显著的防治效果。张文芝[8]从番茄根际土壤中分离获得 1株蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）AR156，该菌株对根结线虫有很好的防治效果。邱思鑫等[9]从茄科作物体内分离筛选出1株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TB2，对黄瓜枯萎病菌、番茄青枯病菌和辣椒疫病菌都有较好的拮抗作用。

为了提高菌株抑菌活性物质的产量，增加其防治效果，王哲等[10]采用单因素多浓度试验和响应面设计法，对解淀粉芽孢杆菌KLBMP-033的发酵条件进行了优化，其优化后的发酵物对可可球二孢的抑菌率从53.3%提高到了83.2%。周青等[11]对解淀粉芽孢杆菌BS2004的培养条件进行优化后，青枯病菌的抑菌圈直径达到21.75 mm，对番茄青枯的防治效果达80%，对十字花科根肿病的防效达60%，可促进作物增产192%。

本研究前期从梓树上分离到1株对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌等多种病原菌有较好拮抗作用的内生细菌GZ-5，经初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。为进一步提高其生防效果、降低发酵成本、开发其应用价值，通过测定在不同条件下抗病促生菌的菌体生长量和芽孢数优化其发酵条件，并通过盆栽测定了GZ-5菌株的促生作用，以期为该菌株的开发及利用奠定试验基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 解淀粉芽孢杆菌GZ-5菌株为山西省植物内生菌服务共享平台分离纯化菌种，保存于山西省绿色生物农药工程技术研究中心。

1.1.2 供试培养基 NA培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂粉 16 g，pH 值 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，定容至 1 000 mL。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，NaCl 12 g，pH值7.0，蒸馏水定容至1 000 mL。

NB培养基：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值7.0，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 最佳碳源的筛选

1.2.1.1 种子发酵液制备 将GZ-5菌株活化后接种于NB培养液中，30℃，160 r/min振荡培养12 h获得种子发酵液。

1.2.1.2 碳源设置 以LB为基础培养基，分别以淀粉、乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖等替换培养基中的碳源，并按照1%的接种量，分别接入GZ-5菌株种子液，于30℃条件下，160 r/min振荡培养48 h后测定各处理发酵液中的芽孢数和菌体生长量。3次重复。

1.2.1.3 芽孢含量和菌体生长量测定 将待测样品置于80℃水浴锅中水浴10 min，使未形成芽孢的菌体失活，自然冷却后利用显微镜和血球计数板进行直接计数，计算芽孢量[12-13]。菌体生长量用发酵液的OD600表示，采用紫外分光光度计进行测定[14]。

1.2.2 最佳氮源的筛选 以蛋白胨、尿素、牛肉膏＋酵母粉、牛肉膏＋酵母粉＋蛋白胨、酵母粉＋胰蛋白胨、牛肉膏＋蛋白胨和酵母粉＋蛋白胨替换培养基中的氮源。并于30℃条件下，160 r/min振荡培养48 h后测定各处理发酵液中的芽孢数和菌体生长量，测定方法同1.2.1。重复3次。

1.2.3 最佳发酵条件筛选 建立温度、初始pH、接种量、装液量4因素3水平的正交试验，设9种组合方式。温度（A）分别设25，30，35℃共3个梯度；接种量（B）分别设0.1%，0.3%，0.5%共3个梯度；初始pH（C）分别设6，7，8共 3个梯度。在500 mL的三角瓶中，装液量（D）分别装入 100，200，300 mL发酵培养液3个处理。于160 r/min条件下发酵培养48 h后，对芽孢数和菌体生长量进行测定。

1.2.4 GZ-5菌株的促生作用测定 将GZ-5菌株在最佳培养条件下发酵培养48 h获得菌株发酵液，发酵液经12 000 r/min，4℃离心10 min，分别获得上清液和细菌菌体，并将菌体加入到与发酵液等体积的无菌水中，制成菌悬液。上清液和菌悬液分别稀释一定的倍数后备用。选取大小长势基本一致的2～3叶期的番茄幼苗作为试验对象，分别浇灌原液、5倍、10倍、50倍、100倍的稀释液，放置人工气候箱中培养（培养温度25℃，湿度为70%，光照时间每天16 h），20 d后测定各处理番茄苗的株高、鲜质量和干质量。重复3次。同时以营养液和无菌水为对照。

2 结果与分析

2.1 最佳碳源筛选结果

GZ-5菌株经发酵48 h后，菌体生长量及芽孢量如图1所示。从图1可以看出，最适合GZ-5菌株生长的碳源为葡萄糖，其OD600可达2.03，其次为蔗糖、果糖，而淀粉、乳糖、麦芽糖较低；最适合GZ-5菌株产芽孢的碳源为葡萄糖，芽孢生成量为3.87×109cfu/mL，其次为蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、果糖。因此，选择葡萄糖为促进GZ-5菌株生长的最佳碳源。

2.2 最佳氮源筛选结果

以葡萄糖为碳源筛选适合GZ-5菌株生长的最佳氮源，筛选结果如图2所示。

由图2可知，GZ-5菌株在含有不同氮源的培养基中生长量和生成的芽孢量不同，其中，最适合菌株生长的氮源为牛肉膏+蛋白胨，发酵48 h，其发酵液OD600为1.95，其次为蛋白胨＋酵母粉、牛肉膏＋蛋白胨＋酵母粉；而芽孢生成量最多的为牛肉膏＋蛋白胨＋酵母粉，发酵48 h，其发酵液中芽孢量为3.18×109cfu/mL。因此，选择牛肉膏+蛋白胨+酵母粉为GZ-5菌株的最适氮源。

2.3 最佳发酵条件筛选结果

菌体生长量及芽孢量最适发酵条件测定结果如表1所示。方差分析结果表明（图3），在不考虑各因素之间的交互作用时最优组合是A2B2C3D1或A2B3C1D2（表1）；在考虑有关因素的交互作用时，通过正交试验方差分析可以得出，以芽孢量为基准的最优组合为A2B2C2D2（图3，表2）。由方差分析结果可知，最佳发酵条件是：温度30℃、接种量0.3%、初始pH7.0、装液量为500mL三角瓶中装入200mL。

表1 内生细菌GZ-5发酵条件优化正交试验结果

表2 最优组合结果

2.4 GZ-5菌株促生作用测定结果

促生测定结果表明，GZ-5菌株发酵液及菌悬液均对番茄幼苗的生长表现出一定的促生作用。从图4可以看出，GZ-5菌株的发酵液10倍稀释液处理番茄幼苗20 d后，其株高、鲜质量、干质量分别比对照增加了37.48%，19.98%，35%，且达到了显著水平，其他处理除发酵原液表现出一定的抑制作用外，均表现出促生。而从图5可以看出，GZ-5菌株的菌悬液原液处理番茄幼苗20 d后，其株高、鲜质量、干质量分别比对照增加了49.17%，49.45%，49.44%，且达到了显著水平，其他处理也均表现出促生作用。

3 结论与讨论

拮抗菌或其他生防菌发酵条件的优化是菌株投入生产应用的先决条件，碳源、氮源、温度、pH、接种量、培养时间等都会影响到芽孢杆菌的生物量及芽孢数量。车晓曦等[15]研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌SAB-1的最佳发酵条件为：温度31℃，初始pH 6.0，接种量1%，250 mL三角瓶中装液量50 mL，180 r/min、发酵培养26 h。权春善等[16]研究发现，解淀粉芽孢杆菌Q-12的最佳发酵条件为温度33℃、初始pH 6.0、最佳培养时间为40 h。信珊珊等[17]研究得出，解淀粉芽孢杆菌WH1的最佳发酵条件以溶氧量在30%以上、时间为48 h最佳。本研究结果表明，菌株GZ-5的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源是牛肉膏＋酵母粉＋蛋白胨，最适发酵条件为温度30℃、初始pH 7.0、接种量0.3%、装液量为500 mL三角瓶中装入200 mL，在此条件下，发酵培养48 h左右，菌体生物量及芽孢生成量均达到最佳。这与高振峰[18]的研究结果类似。

IDRISS等[19]通过试验表明，解淀粉芽孢杆菌可通过分泌生长素类似物（IAA）来促进植物的生长。宋永燕等[20]研究LM-3对水稻的促生作用时也发现，低浓度拮抗菌对植物有促生作用，但较高浓度处理却出现抑制作用。本研究发现，GZ-5发酵液的不同稀释倍数对番茄幼苗均表现出先增大后下降的趋势，10倍稀释液对番茄幼苗的生长最好。这与李哲[21]在小麦上的解淀粉芽孢杆菌FZB42的促生试验结果相似。本试验仅通过室内盆栽测定了GZ-5菌株的促生作用，但对于该菌株的田间促生效果和促生机制等还有待于进一步的研究。