油菜薹和蕾中硫代葡萄糖苷组分及含量分析

彭 君胡 阳龚 照林处发高长斌*汪爱华*

（1华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉 430070；2武汉市农业科学院，湖北武汉 430070；3长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025；4荆州农业科学院，湖北荆州 434000）

硫代葡萄糖苷（glucosinolate，简称硫苷）是广泛存在于十字花科植物中的一类含硫的阴离子次生代谢产物（Brader et al.，2006），尤其在芸薹属植物中含量较高。迄今为止，约有120种硫苷被分离鉴定，但仅20种左右能在十字花科植物中检测到（Kirkegaard & Sarwar，1998）。所有的硫苷都由1个含糖基团、硫酸盐基团和可变的非糖侧链（R）组成。根据侧链R基团的不同，可以将硫苷分为脂肪族、芳香族和吲哚族3类（Mithen，2001）。有研究报道在油菜籽中检测到6种硫苷成分，包含5种脂肪族硫苷和1种吲哚族硫苷，其中脂肪族的2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）含量最高（彭爱娟 等，2000）。而在甘蓝中4-甲基亚磺酰丁基硫苷的含量最高，其是公认的抗癌蔬菜紫甘蓝和青花菜的主要抗癌活性成分（Schlaich，2007）。

十字花科蔬菜富含黑芥子酶（myrosinase，EC3.2.3.1），当植物组织受到机械损伤或者昆虫侵害时，硫苷与芥子酶相遇而发生水解反应，生成异硫氰酸盐（isothiocyanates）、硫氰酸酯（thiocyanates）和腈类（nitriles）等降解产物（汪俏梅和曹家树，2001）。硫苷与这些降解产物具有多种生物学功能，如参与植物防卫反应、刺激昆虫取食、预防癌症发生、赋予植物特殊风味等（陈亚洲和阎秀峰，2007；申树芳 等，2009），其中4-甲基亚磺酰丁基硫苷（glucoraphanin，RAA）的降解产物萝卜硫素（sulforaphane，SF）的抗癌作用已在青花菜中证实，可有效降低多种癌症的发病率（Lin et al.，1998；Ambrosone et al.，2004；Sarikamis et al.，2006）。甲基硫代烷基硫苷的水解产物是十字花科植物具有独特风味的主要物质（程坤 等，2010）。而2-羟基-3-丁烯基硫苷却对人体有害，其降解产物恶唑烷-2-硫酮会引起家畜甲状腺肿大（Fenwick et al.，1983；Pearson et al.，1983）。

油菜（Brassica napus）是重要的油料作物，亦是近几年新兴的一种薹用蔬菜。油菜薹具有产量高、经济效益好、风味独特等优点，深受菜农和市民的欢迎。本试验通过对30个油菜品种薹和蕾中硫苷组分及含量的测定，分析不同硫苷水平下各组分及含量的变化，探明油菜薹、蕾中硫苷的主导成分及含量差异，进一步探讨降低油菜薹中有害硫苷组分含量、提高有益硫苷组分含量的可能途径，以期为选育高品质的薹用油菜品种提供理论依据。同时，开展油菜中硫苷性状研究还将有助于了解硫苷的合成代谢，有助于运用基因工程技术进一步培育安全、风味好、具有保健作用的薹用油菜新品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取来源于世界各地的30个油菜品种，其中中国10个、英国2个、日本1个、新西兰1个、澳大利亚4个、德国3个、芬兰2个、俄罗斯1个、波兰1个、法国2个、荷兰1个、瑞典2个，品种名称及抽薹特性见表1。30个油菜品种均种植于中国农业科学院油料作物研究所（武汉）试验基地，2018年3月在油菜花蕾期分别对蕾和薹进行取样、编号，每个编号3次重复，液氮迅速冷冻，真空冷冻干燥后于-80 ℃保存备用。

表1 参试30个油菜品种名称、来源及抽薹特性

1.2 硫苷的提取及UPLC分析

硫苷的提取参考国标油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定方法（NY/T 1582—2007）。准确称取0.2 g冷冻干燥样品于5 mL A离心管中，加入2 mL 70%沸甲醇后，立即加入200 μL 5 mmol·L-1内标溶液（苯甲基硫苷），75 ℃恒温水浴10 min，每隔2 min旋涡混匀1次，取出离心管冷却至室温，5 000 r·min-1离心3 min，转移上清液至B离心管中；向A离心管中再加入2 mL 70%沸甲醇，旋涡混匀，75 ℃恒温水浴10 min，每隔2 min旋涡混匀1次，取出离心管冷却至室温，5 000 r·min-1离心3 min，转移上清液至B离心管中；用水调节B离心管中的提取液至5 mL，取1 mL经DEAE离子交换微柱，然后用1 mL 0.02 mol·L-1醋酸钠溶液冲洗离子交换微柱2次，每次加入后均让液体排干；加入200 μL硫酸酯酶溶液至离子交换微柱封口，35 ℃条件下反应16 h，次日用1 mL水冲洗离子交换微柱2次，洗脱液收集于5 mL试管中，用水将洗脱液定容至5 mL，混匀后用0.45 μm的微孔滤膜过滤后用于超高效液相色谱（UPLC）分析（李培武 等，2005）。

1.3 数据处理

采用SPSS 23.0软件进行数据统计分析。检测样品峰值重叠的硫苷组分含量视为0 μmol·g-1。

2 结果与分析

2.1 油菜薹和蕾中硫苷组分及含量分析

由图1可见，参试30个油菜品种总硫苷含量的变异范围较大，在21.67～119.29 μmol·g-1之间，均值为65.32 μmol·g-1，标准差为6.65，变异系数为0.10%。其中，HJa82799的总硫苷含量最高，利戈勒-1的总硫苷含量最低。

从30个油菜品种中共检测到7种硫苷组分（表2），薹与蕾中具有相似的硫苷组分；其中脂肪族硫苷4-戊烯基硫苷和2-羟基-3-丁烯基硫苷含量较高，两者在薹和蕾中的含量分别占总硫苷含量的46.24%、28.52%和45.19%、29.13%；4-羟基-3-吲哚甲基硫苷的含量最低，在薹和蕾中的含量占比分别为0.41%、0.44%；4-戊烯基硫苷和3-丁烯基硫苷的标准差较大，表明其在不同油菜品种间的含量差异明显；2-羟基-3-丁烯基硫苷的变异系数最小，表明其在不同品种间较稳定。

由图2可见，油菜薹与蕾之间的硫苷含量差异明显，30个油菜品种薹中硫苷含量为10.66～60.54 μmol·g-1， 蕾 中 为 8.92～61.28 μmol·g-1； 其 中Lesira、LEDOS、HJa82470的差值较大，分别为24.55、27.61、25.22 μmol·g-1。大多数油菜品种蕾中的硫苷含量高于薹，蕾中硫苷含量的均值为37.26 μmol·g-1，薹中为 28.06 μmol·g-1。

图1 油菜总硫苷含量

表2 油菜薹和蕾中硫苷组分、含量均值及变异系数

2.2 不同硫苷水平下油菜薹和蕾中的硫苷组分及含量分析

进一步根据总硫苷含量的高低将参试油菜品种分为3类（李培武 等，2005）：低硫苷含量（＜45 μmol·g-1）的油菜品种有8个，占比为26.7%；高硫苷含量（＞100 μmol·g-1）的油菜品种有3个，占比为10.0%；中硫苷含量（45～100 μmol·g-1）的油菜品种有19个，占比为63.3%。

由表3可知，总硫苷含量低于45 μmol·g-1的8个油菜品种薹和蕾中的硫苷含量均值分别为14.44、16.37 μmol·g-1，脂肪族硫苷含量均值为26.94 μmol·g-1。其中，4-戊烯基硫苷和 2-羟基 -3-丁烯基硫苷的含量较高，两者在薹和蕾中的含量分别占总硫苷含量的34.89%、30.29%和35.71%、30.81%；4-羟基-3-吲哚甲基硫苷的含量较低，在薹和蕾中的含量分别占总硫苷含量的0.68%和1.02%；4-戊烯基硫苷的标准差在薹和蕾中均为最大，表明其在不同油菜品种中的含量差异明显；2-羟基-3-丁烯基硫苷在蕾中的变异系数最小，表明其在低硫苷含量油菜品种中稳定存在。

图2 油菜薹和蕾中的硫苷含量

由表4可知，总硫苷含量高于100 μmol·g-1的3个油菜品种的薹和蕾中的硫苷含量均值分别为53.22、60.08 μmol·g-1，脂肪族硫苷含量均值为106.67 μmol·g-1。其中，4-戊烯基硫苷和2-羟基-3-丁烯基硫苷的含量较高，两者在薹和蕾中的含量分别占总硫苷含量的49.88%、23.53%和42.62%、28.75%；4-戊烯基硫苷和3-丁烯基硫苷的标准差在薹中较大，说明这2个组分是高硫苷含量油菜品种间引起薹硫苷含量差异的主要成分，而引起蕾硫苷含量差异的主要成分则为4-戊烯基硫苷和2-羟基-3-丁烯基硫苷。与低硫苷含量油菜品种相比，4-戊烯基硫苷含量在高硫苷含量油菜品种薹和蕾中的占比分别增加了14.99和6.91个百分点，说明其是引起油菜品种硫苷含量增加的主要成分。

表3 低硫苷含量的油菜品种薹和蕾中硫苷组分及含量

表4 高硫苷含量的油菜品种薹和蕾中硫苷组分及含量

由表5可知，总硫苷含量介于45～100 μmol·g-1之间的19个油菜品种薹和蕾中的硫苷含量均值分别为30.05、42.61 μmol·g-1，脂肪族硫苷含量均值为67.94 μmol·g-1。其中，4-戊烯基硫苷和2-羟基-3-丁烯基硫苷的含量较高，两者在薹和蕾中的含量分别占总硫苷含量的47.06%、29.23%和47.13%、28.84%；4-戊烯基硫苷的标准差最大，是引起中硫苷含量油菜品种间硫苷含量差异的主要成分。与低硫苷含量油菜品种相比，4-戊烯基硫苷含量在中硫苷含量油菜品种薹和蕾中的占比分别增加了12.17和11.42个百分比。

表5 中硫苷含量的油菜品种薹和蕾中硫苷组分及含量

3 结论与讨论

本试验根据总硫苷含量的高低将30个油菜品种分为高硫苷含量、中硫苷含量和低硫苷含量3组，并把每组样品分为薹和蕾2组类别，对不同硫苷含量水平的油菜品种薹和蕾中硫苷组分及含量进行分析。结果表明：30个油菜品种的总硫苷含量变化范围为 21.67～119.29 μmol·g-1，均值为 65.32 μmol·g-1，标准差为6.65，变异系数为0.10%。总体来说，蕾中的硫苷含量比薹高，薹中硫苷含量为10.66～60.54 μmol·g-1，均值为 28.06 μmol·g-1；蕾中硫苷含量为 8.62～61.28 μmol·g-1，均值为37.26 μmol·g-1。已有研究表明，硫苷主要在营养组织中合成（Latiek et al.，2011），本试验亦发现油菜薹中硫苷含量标准差较大。

本试验结果表明，脂肪族硫苷含量在高硫苷含量油菜品种中的均值为106.67 μmol·g-1，是中硫苷含量油菜品种均值的1.57倍，是低硫苷含量油菜品种均值的3.96倍。其中，4-戊烯基硫苷和2-羟基-3-丁烯基硫苷是油菜硫苷组分中的主要成分，且二者在高、中硫苷含量油菜品种中的含量均值与低硫苷含量油菜品种相比差值较大，分别是低硫苷含量油菜品种的3.96倍和2.52倍。2-羟基-3-丁烯基硫苷的含量在不同油菜品种中均较高，但其在高、中硫苷含量油菜品种中的占比却低于低硫苷含量油菜品种；而4-戊烯基硫苷在高、中硫苷含量油菜品种中的占比与低硫苷含量油菜品种相比分别在薹和蕾中增加了14.99、12.17个百分点和6.91、11.42个百分点，说明4-戊烯基硫苷是引起油菜硫苷含量增加的主要成分。

本试验中，脂肪族的4-戊烯基硫苷和2-羟基-3-丁烯基硫苷是油菜中含量较高的硫苷组分，两者累加占总硫苷含量的74.51%。其中2-羟基-3-丁烯基硫苷在油菜薹和蕾中的含量均值分别为 8.00、10.85 μmol·g-1，占比分别为 28.52% 和29.13%。在参试的大部分油菜品种中，2-羟基-3-丁烯基硫苷的含量均较高，因此现阶段选用双低（低芥酸、低硫苷）油菜来作为薹用蔬菜的开发是较好的选择。不同类型蔬菜中硫苷的主要成分不同（李培武 等，2002；陈新娟 等，2006），芥蓝（Brassica alboglabra Bailey）叶片和花薹中硫苷的组分亦不同（李锋 等，2006）。但油菜薹和蕾中含有相似的硫苷组分，4-戊烯基硫苷、2-羟基-3-丁烯基硫苷和3-丁烯基硫苷的含量较高，且标准差大，表明不同油菜品种间硫苷含量差异明显，具有较大的遗传改良潜力。对拟南芥硫苷的研究结果表明，在生物体内硫苷由不同的R基团控制合成，可通过调控硫苷的R基团来改变特定硫苷的含量（Halkier & Du，1997）。本试验以期在提高总硫苷含量的基础上，降低易引起人体甲状腺肿大的2-羟基-3-丁烯基硫苷含量，提高具有抗癌作用的4-甲亚砜丁基硫苷含量，为培育品质优良的薹用油菜新品种提供理论基础。

近年来，硫苷的含量在油菜籽中研究较多，在油菜薹中的研究较少。硫苷合成于营养器官，通过叶片、茎秆运输到种子中，种子中硫苷易积累（李施蒙，2016），硫苷含量的变化也较大，最高达到143.09 μmol·g-1（顾思凯，2017）。在油菜籽高硫苷、中硫苷含量品种中主要组分是脂肪族的2-羟基-3-丁烯基硫苷和3-丁烯基硫苷（李培武 等，2005），与本试验中油菜薹中硫苷的主要组分不一致。油菜薹与油菜籽相同的主要成分为2-羟基-3-丁烯基硫苷。在油菜籽中，对脂肪酸的研究得到突破，降低芥酸含量是油菜长期育种目标（刘后利，2000；傅廷栋，2004）。随着“双低”（低硫苷、低芥酸）油菜大面积推广，传统育种方法无法选育抗病抗虫品种，近年来甘蓝型油菜的代谢途径以及育种研究成为热点。由于油菜基因组的复杂性，绝大多数硫苷的合成和调控基因具有多个拷贝，硫苷合成代谢途径及调控机制仍了解的不够深入（姚琳 等，2018）。有研究表明，硫苷含量变化主要受基因型控制，硫苷含量难以降低是由于低硫苷等位基因可能和其他基因的互作而促进硫苷的正向合成，低硫苷基因的挖掘是培育低硫苷品种的有效途径（陈洪成 等，2014）。随着人民生活水平的不断提高和油菜育种工作的深入发展，油菜薹品质改良已成为重要的育种目标。油菜薹中硫苷的组分和含量影响其营养及风味，加强油菜薹品质性状的研究可以拓宽油菜的利用价值，提高油菜的种植效益，增加农民的收益，丰富市民的菜篮子。同时，开展油菜薹中硫苷性状的研究还将有助于了解硫苷的合成代谢，以及运用基因工程技术进一步培育安全、风味好、具有保健作用的油菜薹品种。本试验首次将油菜薹作为一种新型蔬菜，测定其硫苷组分及含量，可通过远缘杂交或转基因育种等方法提高4-甲亚砜丁基硫苷含量、降低2-羟基-3-丁烯基硫苷含量来进一步提高其营养品质。油菜薹中硫苷含量标准差大，为低硫苷的基因定位以及基因型鉴定提供理论基础。将油菜薹分为薹组织、蕾组织两类，且2-羟基-3-丁烯基硫苷和3-丁烯基硫苷配合力较低的亲本组合有利于培育低硫苷品种（张敏 等，2015），因此培育出营养组织的有利硫苷组分含量高而种子中有害硫苷组分含量低的油蔬两用油菜品种是可行的。