陕西杨凌地区番茄斑萎病毒外壳蛋白基因的克隆与分析

默 宁石 岩秦 蕾李云洲梁 燕*

（1西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100；2贵州大学农学院，贵州贵阳550025）

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）属于布尼亚病毒目（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒科（Tospovirus）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus），被列为世界十大植物病毒之一（Rosel ló et al.，1996；Ullman et al.，2005），最早于1915年在澳大利亚被发现（Brittlebank，1919）。该病毒寄主植物广泛，可侵染84个科1 090种植物。TSWV可系统侵染整株植株，进而导致发病。该病毒的传播介体主要是西花蓟马以持久循环增殖型传播方式传播，传播介体一旦感染该病毒，便会终身带毒（郑雪 等，2013；李云洲 等，2018）。TSWV已在巴西、阿根廷、法国、西班牙、意大利、澳大利亚、美国等国家的番茄生产中造成了严重损失（Jones，2005）。我国于2003年检测出TSWV（Soler et al.，2003），之后随着TSWV危害范围逐年扩大，在四川、云南、广州、山东、河北等地多种园艺植物上均有发现（丁铭 等，2004；张友军 等，2004；Dong et al.，2008；饶雪琴 等，2010；方琦 等，2011；邱树亮 等，2012；郑雪 等，2013）。目前，TSWV在云南等地分布广泛，危害也日趋严重，大棚和温室番茄均有受损，严重时产量损失超过80%，甚至绝收（方琦 等，2011）。

陕西杨凌是我国唯一一处国家级农业高新技术产业示范区，番茄为杨凌地区的主要蔬菜作物。为了了解TSWV在杨凌地区的发病情况以及致病病毒类型，于2016年4～7月在番茄主要栽培示范基地进行调查取样，收集了疑似感染TSWV的番茄样品4份，进行分子鉴定，明确杨凌地区TSWV病毒株系，为杨凌地区番茄TSWV鉴定以及抗TSWV育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 选取杨凌地区感病番茄植株上部幼嫩叶片，锡箔纸包裹后置液氮冷冻5 min后于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.1.2 载体与菌株 pMD18-T购于大连宝生物工程有限公司。大肠杆菌（Escherichia coli）感受态DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 试验方法

2016年4～7月于杨凌区新天地设施大棚中设点观察番茄感染TSWV的症状。采集疑似感病材料发病叶片，液氮速冻，提取叶片RNA，利用TSWV外壳蛋白基因（CP）的特异性引物（F：5′-TCTGTGAGGCTTGCCATAAT-3′；R：5′-A GCATACTCTTTCCCTTTCT-3′）对田间疑似发病叶片进行PCR鉴定。

1.3 杨凌地区TSWV CP基因克隆测序及分析

利用已检测出的阳性材料进行TSWV CP基因的全长克隆，PCR扩增引物为F：5′-ATGTYTAAGGTTAAGCTCACTAAG-3′；R：5′-TT AAGCAAGYYCTGYGAGTTTTGCC-3′，将 PCR 产物送往西安擎科生物公司进行测序，利用DNAMAN 6.0软件对测序所得序列进行比较分析；为了分析杨凌地区TSWV番茄分离物系统进化关系及分类地位，与已有的TSWV分离物，基于TSWV CP基因序列，采用MEGA 5.0软件以邻接法构建系统发育进化树，各分支置信度（bootstrap）进行1 000次重复分析。

2 结果与分析

2.1 番茄TSWV的田间症状观察

番茄感染TSWV后，初期叶片开始有不太明显的深色病斑（图1-B），随着病斑面积的扩大，叶片开始发黄坏死；进而植株的茎上也出现病斑（图1-A），开始时期零星分布，随着症状的发展，病斑连成一片，整棵植株长势越来越弱；绿熟期果实出现明显病斑，表面凹凸不平（图1-C），红熟期果实也有古铜色斑点出现（图1-D）。

图1 杨凌地区设施番茄感染TSWV后的症状表现

2.2 杨凌地区番茄TSWV鉴定结果

用TSWV CP基因的特异性引物对4份供试样品进行PCR检测，其中2份样品扩增到约234 bp的特异性条带（图2-A），经测序后比对，这2份阳性样品扩增出的特异条带序列与GenBank中的TSWV序列相似性均达到98%以上，表明所扩增到的基因片段属于TSWV。

图2 杨凌地区TSWV鉴定（A）及其CP基因的克隆（B）

2.3 杨凌地区TSWV CP基因的克隆与测序

选取TSWV检测为阳性的番茄样品，采用同源克隆方法扩增TSWV的CP基因全长，得到目的片段（图2-B），并对目的片段进行回收，连接pMD-18T，热激转化进大肠杆菌（Escherichia coli，Top10），测序后获得757 bp的TSWV CP基因（图3），ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。

2.4 杨凌地区TSWV CP基因序列的同源性分析

图3 杨凌地区TSWV CP全基因序列

从表1可以看出，杨凌地区TSWV与西班牙TSWV（FR693089.1）CP基因的同源性最高，达到99%；与阿尔及利亚TSWV（FR693045.1）的同源性为90%；与夏威夷TSWV（X61799.1）、中国台湾（HM180089.1）、美国（HQ406983.1）、澳大利亚（AY879109.1）、新西兰（KC494503.1）、土耳其（KM379142.1）、中国云南（KC294570.1）的同源性在79%～86%之间；而与中国昆明TSWV（HQ402595.1）、 韩 国（HM581936.1）、 朝 鲜（KC261949.1）的同源性仅为15%～16%。

从氨基酸序列比对结果可以看出（图4），除 了 中 国 昆 明 TSWV（HQ402595.1）、 韩 国（HM581936.1）、朝鲜（KC261949.1）外，杨凌地区TSWV与其余9个地区的TSWV氨基酸序列的保守区域基本一致。跨膜分析结构显示（图5），杨凌地区TSWV的外壳蛋白具有1个跨膜结构，位于95～122个氨基酸之间。

表1 杨凌地区TSWV与NCBI中12个TSWV CP基因序列的同源性

图4 13个TSWV外壳蛋白氨基酸序列比对结果

2.5 系统进化树分析

系统发育进化树显示（图6），杨凌地区番茄样品的TSWV序列与西班牙TSWV分离物（FR693089.1）处于同一分支，亲缘关系最近，并且二者与阿尔及利亚分离物（FR693045.1）处于同一大支，亲缘关系较近；而杨凌地区TSWV番茄分离物与云南昆明的TSWV分离物亲缘关系较远，昆明TSWV分离物与韩国TSWV分离物的亲缘关系较近。

图5 TSWV蛋白跨膜区的预测结果

图6 基于CP基因序列构建的杨凌地区TSWV分离物及其相关分离物的系统进化树

3 结论与讨论

TSWV在我国出现较晚，但随着西花蓟马的传播，危害范围逐渐扩大，危害也日趋严重（方琦 等，2011），由于地理环境差异，该病毒种类多，亲缘关系复杂。目前关于番茄抗TSWV的标记有9个，分别为 Sw-1a、Sw-1b、Sw-2、Sw-3、Sw-4、Sw-5、Sw-5b、Sw-6、Sw-7（Finlay，1952，1953；van Zijl et al.，1986；Stevens et al.，1991；Canady et al.，2001；Lee et al.，2015），在育种中应用较多的为Sw-5。由于病毒NSs基因突变可以造成Sw-5抗性消失（Jiang et al.，2017），因此了解当地病毒基因序列十分关键。本试验通过分子鉴定获得了杨凌地区TSWV的CP基因序列，为当地番茄抗病育种提供了基础。

国内外已有不少关于番茄斑萎病毒基因克隆及序列比对分析的研究（方琦 等，2011；尹跃艳 等，2013），尹跃艳等（2013）对21个TSWV昆明分离N基因序列进行克隆分析，系统进化分析发现昆明分离物与韩国分离物的亲缘关系很近，而本试验中杨凌地区的TSWV分离物CP基因与西班牙番茄上的TSWV分离物亲缘关系更近，而与昆明的TSWV分离物的亲缘关系较远。可见不同地区的TSWV存在差异。

当前TSWV在我国各地普遍发生，而我国对于TSWV的研究仍处于起步阶段。应首先从研究当地TSWV病毒类型入手，选育适应当地TSWV病毒类型的抗病品种，挖掘新的抗病基因，增加番茄抗TSWV基因的储存量，使抗病基因多样化以适应不同地区的TSWV病毒类型，这对我国番茄TSWV抗性育种工作的开展具有积极意义。