碱提取-丙基化衍生法同时测定土壤中的甲基汞和乙基汞

鲁 立，于建钊，解 鑫，许秀艳

1.贵阳市环境监测中心站，贵州 贵阳 550002 2.中国环境监测总站，国家环境保护环境监测质量控制重点实验室，北京 100012

作为一种剧毒元素，因其毒性与其在环境中的化学形态密切相关，汞的化学形态分析日益受到关注。汞在环境中主要以元素汞、无机汞和有机汞的方式存在。有机汞的毒性远大于元素汞和无机汞，有机汞主要有甲基汞、乙基汞和苯基汞等。甲基汞是毒性最大的有机汞，易于穿透生物膜且通过食物链聚集[1-5]。人体血液中甲基汞的质量分数超过0.2 μg/g时就会出现中毒症状。与甲基汞不同，乙基汞并没有发现具有生物累积性。乙基汞属亲脂性毒物，乙基汞中毒以神经系统和心脏损害较为突出。

人为排放和自然排放的汞可以通过各种途径进入环境，并经过各种循环最终进入土壤和沉积物。此外，土壤中的微生物还可以将无机汞转化为毒性更大的甲基汞，从而增加汞的毒性和生物可利用性[6-7]。因此，对土壤中烷基汞含量的分析测定非常重要。

烷基汞的分析测试方法方面，我国仅有《环境甲基汞的测定气相色谱法》(GB/T 17132—1997)和《水质烷基汞的测定气相色谱法》(GB/T 17204—93)2个相关国家标准方法，这2个方法都存在选择性不佳及灵敏度较低的问题。美国《Methyl Mercury in Wacter by Distillation, Aqueous Ethylation, Pulge and Trap, and CVAFS》(EPA 1630)用于水样中甲基汞的分析，是目前受到广泛认可和应用的汞形态分析方法，其原理为含有甲基汞的水样经蒸馏、乙基衍生化和吹扫捕集等处理后，转化为元素汞后通过冷原子荧光光谱测定[8]。目前，文献关于烷基汞的报道[9-11]也多集中在水体中甲基汞的测定方法研究。

相对水体样品，土壤样品基质复杂，烷基汞的含量较低。准确测定土壤中烷基汞的关键环节在于样品提取过程，在提取过程中既要保证样品中汞化合物的原来形态不发生破坏和转化，又要保证烷基汞从样品中被充分提取以达到稳定可靠的回收效果。目前提取土壤中甲基汞的有效方法主要包括酸浸提和碱提取[12-15]。酸浸提法相比碱提取法操作步骤繁琐，而且当样品中含有大量有机物质时，用酸-有机溶剂萃取会发生严重的乳化现象，产生大量的泡沫，增加了萃取时间和萃取难度。碱提取法操作简便，实用性强，非常适用于环境监测领域批量样品的分析。

本研究建立了碱提取-丙基化衍生法同时测定土壤中甲基汞和乙基汞的方法，并对样品的前处理条件和仪器测定方法进行了深入探讨。该法操作简单，灵敏度高，为土壤中甲机汞和乙基汞的测定提供了方法依据，同时也可为土壤污染调查及风险评估工作提供重要的技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与条件

吹扫捕集/气相色谱-原子荧光光谱仪(美国)，Milli-Q纯水净化仪(德国)，涡旋振荡器(日本)，振荡水浴摇床(日本)，分析天平(精度为0.001 g，中国)，尼龙样品筛(筛孔粒径0.150 mm)。

吹扫捕集气为氩气，吹扫捕集气流速394 mL/min，干燥气为氩气，干燥气流速为297 mL/min，吹扫捕集时间5 min，加热解析时间9.9 s，捕集管干燥时间3 min，气相色谱柱温度46 ℃，气相色谱载气为氩气，气相色谱载气流速22 mL/min。

1.2 试剂

甲基汞沉积物标准参考物质ERM-CC580(欧洲)，甲醇(色谱纯，德国)，氢氧化钾(优级纯，美国)，醋酸钠(优级纯，中国)，冰醋酸(分析纯，中国)，四丙基硼化钠(99%，美国)，氯化甲基汞标准溶液(1 000 μg/L，美国)，氯化乙基汞标准溶液(1 000 μg/L，美国)。

2 mol/L醋酸缓冲溶液：称取27.2 g醋酸钠和11.8 mL冰醋酸溶于实验用水中，定容至100 mL。

25%氢氧化钾甲醇溶液：称量50.00 g氢氧化钾至200 mL甲醇中，盖紧盖子，超声溶解20 min至溶液为乳白色即可。

1%四丙基硼化钠溶液：称量0.80 g氢氧化钾至40 mL棕色样品瓶中，然后移取40 mL实验用水加入瓶中，加盖混匀，放入冰箱冷却至0 ℃(直至出现冰晶)后，加0.4 g四丙基硼化钠，摇匀后迅速将上述溶液分装至色谱进样小瓶中，上盖旋紧，摇匀。-20 ℃冷冻条件保存。随取随用，不可在常温下久置。

1.3 标准曲线的绘制

在5个40 mL棕色样品瓶中分别加入实验用水约35 mL至瓶颈处，使用烷基汞标准使用液配制2、10、50、250、500 pg的标准系列(可根据样品的实际情况适当调整标准系列)，依次加入300 μL醋酸-醋酸钠缓冲液及50 μL 1%四丙基硼化钠水溶液后迅速加入实验用水至瓶满，盖紧盖子摇匀并静置10～15 min后放入自动进样器进行测定。以峰面积为纵坐标，以烷基汞质量(pg)为横坐标，用最小二乘法计算标准曲线的回归方程，绘制甲基汞和乙基汞的标准曲线。

1.4 实验方法

称取0.100～0.150 g土壤样品于50 mL聚丙烯管中，加入2.5 mL 25%KOH甲醇溶液后涡旋混匀。盖紧盖子，置入70 ℃水浴摇床中，振荡提取3 h。取出样品置于通风橱静置冷却至室温后，开盖加入8.0 mL实验用水，盖紧盖子，涡旋混匀，此时管内液体体积为10.5 mL。静置，使管内固体物沉降完全，上清液尽量澄清。

于40 mL棕色样品瓶中加入实验用水约35 mL至瓶颈处，吸取经碱提取后的150 μL试样上清液至样品瓶，然后依次加入300 μL醋酸缓冲液及50 μL 1%四丙基硼化钠水溶液，最后迅速加入实验用水至瓶满，盖紧盖子摇匀并静置10～15 min。在与绘制标准曲线相同的条件下，测定试样和空白试样提取液中烷基汞的含量，以保留时间定性，由甲基汞和乙基汞的标准曲线得到甲基汞和乙基汞的质量(pg)。

2 结果与讨论

2.1 分析仪器条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

在进行气相色谱分析时，色谱柱的选择至关重要。常见的市售毛细管色谱柱如DB-1、DB-5MS、 DB-17均可被用来分离甲基汞、乙基汞和Hg2+的衍生化产物。填充柱方面，普通OV-3柱只能有效分离Hg0和甲基丙基汞。改性OV-3柱可以实现Hg0、甲基丙基汞、乙基丙基汞、二丙基化汞的有效分离(图1)。考虑到所用仪器接口情况，本实验中选用OV-3填充柱(改性)，实现目标化合物的分离。

图1 色谱柱对目标物分离效果的影响Fig.1 Effect of chromatographic column on the separation of Hg0, methyl propyl mercury, ethyl propyl mercury and two propyl mercury

2.1.2 载气的影响

本研究考察了2种常用载气对烷基汞分析的影响，如图2所示。采用氩气作为载气时，目标物的响应值明显高于以氮气作为载气时的响应值。因此选用氩气作为载气。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 衍生化试剂及衍生化反应

四乙基硼化钠、四丙基硼化钠和四苯基硼化钠是最常用的汞烷基化试剂[16-17]。如果采用四乙基硼化钠作为烷基化试剂，土壤中二价汞和乙基汞衍生化产物同为乙基乙基汞，容易造成假阳性。由于本研究同时测定甲基汞和乙基汞，可以选用四丙基硼化钠或者四苯基硼化钠作为衍生化试剂。但四苯基硼化钠作为衍生试剂时的衍生产物的沸点高，挥发性较差，不适宜采用气相色谱进行分离。因此，最终选取四丙基硼化钠作为衍生化试剂。

图2 载气种类对目标物测定灵敏度的影响Fig.2 Influence of carrier gas on the sensitivity of Hg0, methyl propyl mercury, ethyl propyl mercury and two propyl mercury

二价汞、甲基汞和乙基汞在四丙基硼化钠的衍生下，分别生成丙基丙基汞、甲基丙基汞和乙基丙基汞，见式(1)～式(3)。

CH3Hg++NaB(C3H7)4→CH3-Hg-C3H7+

B(C3H7)3+Na+

(1)

C2H5Hg++NaB(C3H7)4→C2H5-Hg-C3H7+

B(C3H7)3+Na+

(2)

Hg2++2NaB(C3H7)4→Hg(C3H7)2+

2B(C3H7)3+2Na+

(3)

2.2.2 pH对衍生化反应的影响

衍生化反应过程与pH密切相关。图3给出了甲基汞和乙基汞在pH 3～7之间的丙基化衍生效果。由图3可以看出，甲基汞和乙基汞在pH 4～6范围丙基化衍生效率较高。

稳定调节丙基化衍生反应水相体系的pH，添加一定体积的醋酸-醋酸钠缓冲溶液是行之有效的方式。考察了甲基汞和乙基汞质量均为100 pg时，衍生反应水相体系pH随缓冲液加入量的变化情况。研究发现：当不添加缓冲溶液时，衍生反应水相体系pH为11.45；当缓冲液加入量为100 μL时，衍生反应水相体系pH降至6.03；当缓冲溶液加入量为300 μL时，衍生反应水相体系pH为5.03；继续加大缓冲液加入量，衍生反应水相体系pH已趋于稳定，而缓冲溶液本身pH为4.65，说明当缓冲溶液加入量为300 μL时已达到衍生反应水相体系的最佳pH条件。图4甲基汞和乙基汞的回收率随缓冲液加入量的变化曲线也进一步证实了该结论。

图3 pH对烷基汞丙基化衍生化反应效率的影响Fig.3 Effect of pH on the efficiency of alkylation reaction of alkyl mercury

图4 甲基汞和乙基汞的回收率随缓冲液加入量的变化曲线Fig.4 The curves of the recovery of methylmercury and ethyl mercury with the addition of buffer

2.2.3 衍生化试剂加入量优化

四丙基硼化钠的加入量直接影响衍生化反应效率，加入量过少，衍生化反应不完全，加入量过多，衍生化反应过快容易导致衍生产物挥发损失。图5给出了水相中甲基汞和乙基汞质量分别为1 000 pg时，烷基汞丙基化衍生产物回收率与四丙基硼化钠加入量的关系曲线。由图5可以看出，当四丙基硼化钠的加入量为30～90 μL时，衍生化效果无显著差异。综合考虑衍生化试剂的稳定性和土壤基体的复杂性，本研究确定四丙基硼化钠的加入量为50 μL。

图5 衍生化试剂加入量对烷基汞衍生化效果的影响Fig.5 Effect of the amount of derivatization reagent on the derivatization of alkyl mercury

2.2.4 提取温度和提取时间的确定

提取温度和提取时间是碱提取前处理的关键参数，直接影响土壤中烷基汞的提取效率。分别称取0.100～0.150 g ERM-CC580于50 mL聚丙烯管中，添加7 000 pg乙基汞标液后加盖漩涡混匀，开盖后加入2.5 mL 25% KOH甲醇溶液，再次加盖涡旋混匀。分别置入50、60、70、80、90 ℃水浴摇床中振荡，控制每个提取温度下提取时间分别为1、2、3、4、5 h时将提取样品取出，然后按照实验方法完成后续操作。实验中发现，90 ℃条件下，聚丙烯管盖子容易受热断裂，直接影响后续实验结果，因此只考察了50～80 ℃提取温度下甲基汞和乙基汞的回收率随提取时间延长的变化趋势，详见图6。综合考虑提取条件下甲基汞和乙基汞的回收率结果，最终确定的提取温度为70 ℃，提取时间为3 h。

2.3 方法评价

按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)的相关规定，重复分析9个接近于检出限浓度的空白加标样品，通过计算，甲基汞和乙基汞的方法检出限分别为0.5 μg/kg和0.3 μg/kg。标准曲线在2～500 pg范围内线性相关系数大于0.999，线性良好。

平行测定CC580沉积物样品(75 μg/kg)9次，平均回收率为85.3%，相对标准偏差(RSD)为5.9%。

2.4 实际样品分析结果

选取具有代表性的5种土壤样品，分别为辽宁棕壤土、河南黄潮土、四川紫色土、江西红壤土和黑龙江黑土，测得所有土样中均不含有甲基汞和乙基汞。对实际样品进行低、中、高加标测定，每个样品平行处理8份。考察甲基汞和乙基汞的精密度与准确度，结果详见表1。由表1可以看出，甲基汞和乙基汞的相对标准偏差分别为1.3%～17%和0.94%～16%，甲基汞和乙基汞的平均回收率分别为88.2%～110%和66.1%～110%。

图6 甲基汞和乙基汞的回收率随提取温度和提取时间的变化趋势Fig.6 The change trend of recovery rate of methylmercury and ethyl mercury with extraction temperature and extraction time

表1 土壤样品的加标结果Table 1 Spike results of soil samples %

3 结论

应用碱提取-丙基化衍生法同时测定土壤中甲基汞和乙基汞，两者的方法检出限分别为0.5 μg/kg和0.3 μg/kg。应用于实际土壤样品分析，相对标准偏差分别为1.3%～17%和0.94%～16%，平均回收率分别为88.2%～110%和66.1%～110%。该法操作简单，灵敏度高，适用于批量土壤中甲基汞和乙基汞的分析。