GALNT2基因启动子区甲基化与急性脑梗死的相关分析

郭 丹，刘 丹，张广炜

GALNT2 基因属于多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族中的一员 ，其主要功能是参与O-糖基化的第一步反应[1]。在已知的研究中表明GALNT2基因内中1q42突变与血浆中高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)与甘油三酯(triglyceride，TG)水平有关[2]，它是脂蛋白脂肪酶(LPL)的抑制剂，LPL在极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒中水解TG，影响HDL-C和TG水平[3]。近些年来，DNA甲基化已成为新的研究热点，是指S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)上的甲基在DNA甲基转移酶(DNA methyl transferase,DNMT)的催化作用下,与胞嘧啶的C5位结合形成甲基胞嘧啶(5 mC)的化学修饰过程[4]。DNA甲基化主要发生在CpG异二核苷酸上，主要集中于CpG岛，而该区域主要集中于一些基因的启动子区，而CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与DNA结合而抑制基因的转录，最终影响基因的表达。已知GALNT2基因启动子区甲基化的转变将会影响基因的表达，降低HDL-C,升高TG，引起脂质代谢紊乱，促使动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成与发展。而本课题主要是研究GALNT2基因启动子区甲基化与急性脑梗死之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 病例组随机选择在我院神经内科2017年9月-2018年10月住院的急性脑梗死患者84例,均为汉族 ,彼此无亲缘关系。对照组选择同一时间段来我院住院的非急性脑梗死患者90例。 病例组入选标准：(1)年龄≥18 岁；(2)发病时间≤7 d；(3)脑梗死诊断符合1996年全国第四届脑血管病学术会议修订的脑梗死的诊断标准，且经头部CT或MRI检查证实。 病例组排除标准：(1)既往曾有脑出血病史或CT显示存在脑出血;(2)有明显的心、肝、肾功能不全及恶性肿瘤;(3)存在心房颤动等严重心律失常;(4)心源性栓塞所致的卒中。

1.2 方法与分组 病例组与对照组于入院次日清晨采集肘静脉血共计2 ml，用抗凝管编号后放入-20 ℃低温冰箱保存。进行亚硫酸氢盐修饰基因组DNA和基因组DNA纯化回收，甲基化特异性 PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)检测和琼脂糖凝胶电泳判定甲基化结果，用BECKMAN LX20全自动生化仪(美国 Beckman Coulter公司)测胆固醇(total cholesterol，TC)、TG、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)。

2 结 果

2.1 病例组和对照组的一般资料和临床实验指标对比P值来源于独立样本t检验及χ2检验，结果显示年龄、性别、空腹血糖、TC、TG、LDL-C的组间P>0.05，差异无统计学意义；而收缩压、舒张压、抽烟史、饮酒史、HDL-C的组间P值<0.05，差异有统计学意义(见表1)。

2.2 GALNT2基因甲基化特异性PCR检测结果 采用甲基化和非甲基化特异性引物扩增被亚硫酸氢盐修饰转化后的对照组和病例组DNA时，GALNT2甲基化引物与非甲基化引物扩增得到预期大小的扩增片段如(见图1)。

在检测的急性脑梗死组患者血液标本GALNT2基因启动子区甲基化阳性人数为45人，其甲基化阳性率为53.57%，而对照组阳性人数为25人，其甲基化阳性率为27.78%，P<0.05为差异有统计学意义。

图1 GALNT2基因甲基化特异性PCR检测电泳图。M：甲基化引物扩增产物;U：非甲基化引物扩增产物

2.3 病例组与对照组一般资料、临床实验指标、GALNT2基因启动子区甲基化的相关性分析 分别对病例组与对照组和年龄、性别、抽烟、饮酒、血压、血脂及GALNT2基因甲基化情况进行Pearson线性相关或Spearman秩相关分析(正态分布数据进行Pearson相关分析，偏态分布数据进行Spearman秩相关分析)，结果显示：急性脑梗死与抽烟(r=0.349，P=0.000)、饮酒(r=0.162，P=0.033)、收缩压(r=0.259，P=0.001)、GALNT2基因启动子甲基化阳性情况(r=0.263，P=0.000)均为正相关；而与HDL-C(r=-0.255，P=0.001)为负相关，表明抽烟、饮酒、高血压、GALNT2基因启动子区甲基化阳性与低的HDL-C均为急性脑梗死发病的危险因素(见表2)。

2.4 急性脑梗死发病危险因素的Logistic回归分析 将急性脑梗死与其危险因素进行相关分析中的P<0.05的各变量进行Logistic回归分析，在校正其他危险因素后，结果显示：抽烟史、收缩压、HDL-C、GALNT2基因启动子区甲基化阳性与急性脑梗死的发病明显相关，可能是急性脑梗死发病的独立危险因素。其中GALNT2基因启动子区甲基化每增加1倍，急性脑梗死发病率增加2.346倍(95%CI1.160～4.743)(见表3)。

表1 病例组和对照组的一般资料与临床实验指标对比

病例组与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

表2 病例组与对照组一般资料、临床实验指标、GALNT2基因启动子区甲基化的相关性分析

注：*P<0.05，**P<0.01，r为相关系数，P为对年龄、性别、抽烟、饮酒、血压、血脂、GALNT2基因启动子区甲基化指标进行Pearson线性相关分析或Spearman秩相关分析的P值

表3 急性脑梗死发病危险因素的Logistic 回归分析

3 讨 论

急性脑梗死占我国脑卒中的69.6%～70.8%[5]，其中有大约75%的人存在不同程度的劳动力丧失和生活不能自理，同时有大约1/4～3/4的脑梗死患者在2～5 y内会发生新的脑梗死。随着人们生活水平的提高，生活方式的改变，脂质代谢紊乱对脑梗死的影响成为目前的研究热点。而脂代谢紊乱是AS发生发展的关键因素之一，通常表现为HDL-C水平显著降低和(或) TC、TG、LDL-C水平明显升高[6]。脂质代谢失衡诱发炎症反应，AS的起始是由于动脉壁破坏、动脉壁内皮细胞表达的炎症趋化因子导致白细胞迁移，而吞噬了脂质的单核细胞或组织细胞与实验结果结合则形成了泡沫细胞，胆固醇是组成泡沫细胞的主要物质。脂质代谢紊乱与炎症反应是AS形成的两个必备条件。而与脂代谢紊乱有关的GALNT2基因甲基化的改变是否是脑梗死的危险因素则成为我们今天的研究热点。

本实验的结果表明，HDL-C水平降低是急性脑梗死发病的危险因素，线性相关分析显示与急性脑梗死的发病呈负相关，且经过Logistic回归分析表示低的HDL-C是急性脑梗死发病的独立危险因素与已有的研究在AS引发的心脑血管疾病中，HDL-C的升高是与主要的危险因素相吻合[7]。

本研究中，在入组的急性脑梗死的患者中，GALNT2甲基化阳性率为53.6%，而对照组甲基化阳性率为28%，明显高于对照组，且与GALNT2甲基化阳性呈正相关，这提示GALNT2基因甲基化的改变可能与急性脑梗死的发生有着密切的关系，且Logistic回归分析显示GALNT2基因甲基化改变是急性脑梗死的独立危险因素。而且发现抽烟、饮酒、收缩压异常也是急性脑梗死发病的危险因素，且抽烟、饮酒、收缩压与急性脑梗死呈正相关，并且经过Logistic回归分析发现抽烟史、收缩压为急性脑梗死发病的独立危险因素，与大量的流行病学调查发现[8]，抽烟史与急性脑梗死发病的独立危险因素一致，这主要是因为烟草中的尼古丁、一氧化碳及焦油会使内皮细胞受损，引起内皮功能紊乱，进而加速AS的形成，从而引起急性脑梗死的发生。并且根据王薇等人[9]的调查研究表明，收缩压/舒张压增高，均会增加脑卒中的发病风险与本课题的研究结果收缩压是急性脑梗死发病的独立危险因素相吻合。

本课题的不足之处：我们已知的脑梗死的危险因素糖代谢异常、血脂代谢紊乱、收缩压和/或舒张压的异常[10,11]，在本课题的研究中未得出阳性结论，可能与患者正在服用降血糖药物或应用胰岛素控制血糖、服用降压药物控制血压、服用他汀类药物调节血脂有关，也可能与纳入的样本量少，并且血压采用的是入院时两次测量血压取平均值所得血压，结果存在一定的局限性，需要后期进行足够多数据的临床实验研究证明。

综合以上的研究，我们可以发现GALNT2基因启动子甲基化,不仅可以引起脂质代谢紊乱，还与急性脑梗死的发病存在密切的关系，所以通过检测GALNT2基因启动子区的甲基化情况来预测急性脑梗死的发生风险，同时也为急性脑梗死的基因治疗和预防提供了的新思路。