MiRNA-145与miRNA-146a在缺血性脑卒中的表达研究

侯丽淳，杨 慧，关雪莲，毕 胜，秋大成，冯秀娟，王 菲

脑血管疾病已经成为目前世界上导致我们人类死亡的最主要三大疾病之一，而缺血性脑卒中在脑血管疾病中又是最常见的类型，约为所有脑血管疾病的70%左右[1,2]。我国正面临着人口老龄化的现状，缺血性脑卒中发病率的逐年快速升高给社会以及家庭都带来了沉重的负担。因此，了解缺血性脑卒中的发生及发展等情况，尽早地对其进行干预，对缺血性脑卒中的治疗和预防有着极为重要的临床意义。随着近些年人们对microRNA研究的不断深入，发现了microRNA在人类某些疾病的发生与发展一直起着尤为重要的作用，发病率逐年升高的缺血性脑卒中受到越来越多人们的关注[3～5]。本实验选择研究miRNA-145和miRNA-146a在缺血性脑卒中血清中的表达是基于前期关于CD40和CD40L与缺血性脑卒中的研究基础上，通过生物信息学的方法预测miRNA-145和miRNA-146a为编码CD40和CD40L的靶基因，因此我们进一步对miRNA-145和miRNA-146a在缺血性脑卒中血清中的表达以及与缺血性脑卒中发生与发展的相关性进行研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料 病例选择为2017年1月-2017年6月在我科住院治疗的缺血性脑卒中患者100例作为病例组，同期来我院门诊体检的40岁以上非缺血性脑卒中病史的健康体检者50例作为对照组。入选标准：病例组按照1995年全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准选择病例，经过头部CT或MRI等检查手段证实为缺血性脑卒中患者，并且患者年龄在40岁以上，发病时间在1 w以内，经过头部CTA、MRA或颈部血管彩超等检查手段证实为大动脉粥样硬化型缺血性脑卒中患者。对照组为40岁以上，经过头部CT或MRI等检查手段证实为非缺血性脑卒中病史的健康体检者。排除标准：如果研究对象存在下列任何一种情况时则需要将其排除在外：心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他病因型及不明原因型引起的缺血性脑卒中；合并有心脏疾病(心肌梗死、心房颤动、冠状动脉硬化性心脏病)、合并肝肾功能不全、合并自身免疫系统性疾病、慢性感染性疾病、应用免疫抑制剂治疗的患者。一般临床资料包括：性别、年龄、体重指数(BMI)、血压、血清葡萄糖、血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)和血清HCY。

1.2 方法

1.2.1 收集血清样本 分别抽取病例组和对照组患者清晨空腹肘正中静脉血5 ml置于普通的生化管中，室温条件下静置待其凝固2 h后，室温条件下使用低速离心机3000 rpm离心10 min来分离血清，使用无菌移液器吸取上清液于无菌无酶的离心管中，然后在4 ℃温度条件下再次离心，使用无菌移液器吸取上清液于无菌无酶的离心管中，并将其存放于-80 ℃的低温冰箱中，待下一步进行实验。

1.2.2 测定血清miRNA-145及血清miRNA-146a的表达 提取血清RNA(具体操作按说明书进行)，将样本放置于紫外分光光度仪上，测定结果。检验在波长为260/280 nmRNA的纯度，记录下测量值并计算OD比值(OD260/OD280)，结果在1.8～2.1之间表明纯度较高。根据反转录试剂盒上的操作说明进行操作，完成血清miRNA的反转录。操作在冰上进行。根据荧光定量PCR试剂盒的操作说明进行操作，完成血清miRNA的定量检测。

1.2.3 生化指标的测定 采用全自动生化分析仪测定各项生化指标，具体的检查项目包括血清葡萄糖、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和HCY。

2 结 果

2.1 两组患者的一般资料 病例组中血清TC、TG、LDL-C和HCY水平要明显高于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义;而病例组中性别、年龄、高血压病、BMI、血清葡萄糖、血清HDL-C水平和对照组比较(P>0.05)，差异无统计学意义(见表1)。

2.2 病例组和对照组血清miRNA-145相对含量的比较结果 病例组中血清miRNA-145的表达水平要明显高于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义(见表2，见图1、图2)。

2.3 病例组和对照组血清miRNA-146a相对含量的比较结果 病例组中血清miRNA-146a的表达水平要明显低于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义(见表3，见图3、图4)。

表1 两组患者的一般资料

与对照组比较*P<0.05

表2 血清miRNA-145的相对表达量

与对照组比较t=15.31，P<0.05

表3 血清miRNA-146a的相对表达量

与对照组比较t=-18.49，P<0.05

图1 荧光定量PCR检测病例组与对照组miRNA-145表达

图2 依据图片灰度值相应柱状图

图3 荧光定量PCR检测病例组与对照组miRNA-146a表达

图4 依据图片灰度值相应柱状图

3 讨 论

在前期的实验中我们发现CD40 mRNA 的3’UTR有8个碱基能够完全和miRNA-145互补配对，由此预测miRNA-145为编码CD40的靶基因，而CD40能够导致缺血性脑卒中事件的发生。本实验对miRNA-145在病例组中和对照组中血清中的表达进行定量分析，结果显示miRNA-145在病例组血清中的表达明显高于对照组(8.09±1.88 vs 4.69±0.84)，P<0.05，差异有统计学意义(见表2)。MiRNA-145已经被证明在VSMC表型转换的过程中起着尤为重要的作用，在缺血性脑卒中发生以后血管受损，miRNA-145能够抑制VSMC发生表型转换，使增殖和凋亡渐趋平衡的状态，起到了一种保护的作用。实验中miRNA-145在缺血性脑卒中患者血清检测结果中表达水平上调，我们推测可能的原因是入院时的缺血性脑卒中患者服用了氯吡格雷或阿司匹林等抗血小板聚集的药物，也可能是缺血性脑卒中急性期的一种反馈调节方式，miRNA-145过表达来抑制CD40基因的表达从而减少血管内炎症因子的释放，减少缺血性脑卒中后血管的损伤，但具体的调节方式还需我们进一步对其进行实验分析。类似的研究有对缺血性脑卒中患者和健康体检患者的外周血单个核细胞和血浆中miRNA-145的表达水平进行检测，结果显示缺血性脑卒中患者外周血单个核细胞和血浆中miRNA-145的表达明显高于健康体检患者，这也进一步证明了在缺血性脑卒中患者中miRNA-145的表达水平在检测结果上是上调的[6]。

在前期的实验中我们还预测miRNA-146a为编码CD40L的靶基因，而CD40L也是导致缺血性脑卒中事件的发生的影响因素，因此我们对miRNA-146a在缺血性脑卒中血清中的表达进行研究。本实验对miRNA-146a在病例组中和对照组中血清中的表达进行定量等分析，结果显示miRNA-146a在病例组血清中的表达明显低于对照组(0.25±0.17 vs 1.17±0.33)，P<0.05，差异有统计学意义(见表3)。MiRNA-146a下调可能通过减少对这些因素的抑制作用，进而促进了缺血性脑卒中的发生及发展。MiRNA-146a能够对白介素-1受体相关基因(IRAK-1)进行调控，其在炎症反应及动脉粥样硬化过程中起到了重要的作用，MiRNA-146a的表达下调能够增加白介素-1受体相关基因的表达，也可通过其对CD40L表达的调控，促进炎症因子大量释放，加重炎症相关的AS反应和血管炎性反应，进而在缺血性脑卒中的发生及发展中起到了促进的作用。有研究显示在缺血性脑卒中患者血小板和血浆中miRNA-146a的表达下调，与我们的实验结果相一致。因此我们推测miRNA-146a的表达下调是促进动脉血栓的形成的重要因素，最终导致缺血性脑卒中的发生。但miRNA-146a在缺血性脑卒中的不同时期其表达水平是否相一致，还需要我们进一步对其进行研究。

综上所述，miRNA-145和miRNA-146a和缺血性脑卒中的发生和发展有着非常密切和重要的关系，而我们争取对其进行更进一步的研究，深入探讨其相关机制，为今后缺血性脑卒中的预防与治疗提供更多和更好的新的思路及依据。