知母皂苷Ⅱ对老龄大鼠学习记忆行为及海马区神经元的影响

张敏娜，钟 鸣，王光辉，吴景龙

随着我国老龄化社会现状的加剧，老年人的生活质量也日益成为医学关注和研究的问题，随着年龄的增加老年人往往出现为学习能力和记忆能力的下降，重者表现为阿尔茨海默病等疾病，严重影响老年人的生活质量。

大脑海马区作为学习和记忆的中枢负责处理感外界感觉和知觉刺激信号，并且通过整合形成记忆和学习能力。随着年龄增长，老年人出现的记忆力减退、认知能力受损、对外界刺激反应迟钝等表现与海马区神经元凋亡及功能减退有关[1,2]。相关研究显示老龄诱发免疫系统紊乱和中枢神经系统慢性炎症损伤是神经元死亡的重要原因[3，4]。知母皂苷B-Ⅱ(TB-Ⅱ)是自百合科中药植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge)的主要活性成分[5]，相关研究发现TB-Ⅱ对老年痴呆症、脑血管疾病等导致的认知功能障碍和学习记忆障碍有改善作用[6]，但具体机制有待于进一步深入研究。

本研究初步探讨TB-II对老龄大鼠学习和记忆行为的影响以及对海马区神经元的作用，旨在探索一条改善老龄大脑的学习和记忆功能、延缓脑衰老的新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠体重260～280 g，雌雄不限，SPF级。济宁医学院药学院实验动物中心繁育和养殖。动物实验依据相关伦理学法规尽量减少其痛苦和死亡。22月龄SD大鼠60只，雌雄不限，随机分为老龄大鼠对照组(15只)、根据TB-Ⅱ药物动力学特征设置TB-Ⅱ 1 mg/kg组(15只)、TB-Ⅱ 2 mg/kg组(15只)和TB-Ⅱ 1 mg/kg组(15只)。2月龄大鼠设立为青年对照组 (15只)。大鼠称重记录，连续5 d，生理盐水溶解TB-Ⅱ制成溶液，每24 h经鼠尾静脉给药相应剂量，对照组根据体重注射生理盐水。

1.2 主要试剂与仪器、药品和主要仪器 药品知母皂苷BⅡ购买自成都德斯特生物科技有限公司，ELISA试剂盒由美国R&D Systems公司提供，水迷宫视频分析系统设备购自海欣软信息科技有限公司。TUNEL试剂盒来自碧云天生物技术有限公司。Agilent 1260 Infinity II Prime液相色谱仪和台式高速冷冻离心机购买自美国公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水迷宫定位航行试验(Hidden Platform Test) 测试实验动物对空间位置觉和空间定位学习记忆能力。定位航行试验历时5 d,每天同一时间和地点将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中各一次,记录其入水到站立于水面下隐藏平台的时间，即为逃避潜伏期(escape latency)。开启视频分析系统以s为单位每24 h记录一次，连续进行5次。

1.3.2 ELISA 法测脑脊液IL-6和TNF-α 浓度 大鼠麻醉固定，剥离颈部靠近颅底肌肉,用微量进样器刺入枕骨大孔约2 mm，采集100 μl脑脊液。CSF标本加入后与酶标板上抗体结合，冲洗，加辣根过氧化酶标记亲合素，亲合素复合酶与夹心免疫复合物进行连接，洗涤其他游离成分。加入显色剂经酶催化呈现蓝色，加终止液变黄色，读取450 nm处酶标仪显示OD值，计算IL-6、TNF-α浓度。

1.3.3 海马区细胞凋亡检测 麻醉处死大鼠取脑，精心剥离大脑海马做成组织石蜡切片，经脱蜡、抗原修复破膜、阻断内源性过氧化物酶活性、DAB显色、复染、盐酸酒精分化、返蓝、脱水、中性树胶封片后显微镜下照相，图像处理软件分析细胞。光镜下凋亡细胞呈棕黄色,于高倍镜视野下随机观察来自不同切片20个视野,计数凋亡细胞所占比值。

1.3.4 HPLC法测DA、NE和5-HT浓度 动物处死后剥离海马，比例控制为海马组织重量：PBS 达到1∶20，平均分为3份，分别加乙腈、三氯乙酸和高氯酸沉淀蛋白匀浆冰浴条件混匀。4 ℃ 12000 rpm离心20 min，取上清液400 μml加入氢氧化钠溶液(8 mol/L)调整pH值至中性，经滤膜过滤后测定DA、NE和5-HT浓度。

2 结 果

2.1 动物行为学观测 老龄大鼠逃避潜伏期较青年对照组明显延长，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。在连续5次的实验中，与老龄对照组相比给药组第一个24 h逃避潜伏期差异不明显；第48小时和第72小时逃避潜伏期缩短 (P<0.05)；第96小时和第120小时逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)，各组逃避潜伏期(见表1)。

表1 大鼠逃避潜伏期比较

与老年对照组比较*P<0.05,**P<0.01

2.2 脑脊液IL-6和TNF-α浓度 老龄对照组与青年对照组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)， 给药组随着剂量增加，与老年对照组相比IL-6和TNF-α浓度均降低，差异有统计学意义(P<0.05) (见图1)。

与老龄对照组比较*P<0.05,**P<0.01图1 大鼠CSF IL-6和TNF-α浓度

2.3 海马组织神经元凋亡检测 老龄对照组较青年对照组凋亡神经细胞明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)；给药后与老年对照组相比神经细胞凋亡明显减少，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)(见图2、表2)。

A.青年对照组;B.老龄对照组;C.TB-Ⅱ 4 mg/kg给药组图2 大鼠海马区神经元凋亡情况(×400)

组别细胞凋亡率青年对照组老龄对照组TB-Ⅱ 1 mg/kgTB-Ⅱ 2 mg/kgTB-Ⅱ 4 mg/kg6.25±4.82∗∗18.46±8.3514.90±5.82∗12.85±6.56∗10.13±6.83∗∗

与老龄对照组比较*P<0.05,**P<0.01

2.4 大鼠海马组织主要神经递质含量 老龄大鼠海马组织DA、NE、5-HT与青年组大鼠相比含量明显降低，较差异有统计学意义 (P<0.05，P<0.01)；给药后DA、NE、5-HT与老年对照组比含量均明显上升，呈剂量依赖性，较差异有统计学意义 (P<0.05，P<0.01)，3种神经递质含量测定比较(见表3)。

表3 大鼠海马区神经递质含量比较

与老年对照组比较*P<0.05,**P<0.01

3 讨 论

神经生物学研究结果表明大脑衰老与神经系统慢性炎症互为因果，老年性慢性损伤导致神经元所处微环境稳态被打破，炎症细胞因子和相关抑制因子平衡失调，引发神经元变性、坏死和凋亡[7]。TNF-α既是应激损伤反应的核心炎性因子，又是引发多种神经退行性疾病的主要炎性因子。

TNF-α对神经系统的损伤机制包括收缩血脑屏障内皮细胞、增加内皮细胞间隙、脑部毛细血管通透性增加、引发炎细胞浸润和脑组织水肿，继而诱导IL-1β表达增加，IL-1β诱导星形胶质细胞产生合成分泌NO，NO作为凋亡信号启动分子进一步诱发细胞凋亡发生。另一方面TNF-α通过IL-1受体和L-型钙通道增加钙调磷酸神经酶活性，引发N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的神经元死亡[8]。低浓度IL-6在脑损伤中有神经营养保护作用,但是病理情况下高浓度IL-6则表现为神经毒性作用，诱发神经元和神经胶质细胞变性和死亡。随着TNF-α、IL-6等炎性因子持续损伤作用加剧，最终导致老年人记忆能力减退、认知功能下降等临床症状[9～11]。

前期研究发现知母皂苷能明显对抗脂多糖LPS导致的IL-1β 和iNOS表达水平增加，减轻海马区炎症，明显改善大鼠学习记和记忆行为[12]。另据Patterson等[13～15]研究发现知母皂苷BⅡ提高IL-10和抗炎因子的表达，从而起到改善学习记忆的作用。在以上研究基础上，本实验选取22月龄老龄大鼠为研究对象，与2月龄青年大鼠相比各项指标符合自然衰老大鼠的生物学属性，符合探索老龄大鼠学习和记忆功能的实验目的。实验结果显示知母皂苷BⅡ可显著降低老龄大鼠脑脊液中TNF-α和IL-6水平，并与给药剂量成正相关。

实验结果表明知母皂苷BⅡ抑制老年大鼠中枢神经系统炎症作用。进一步研究发现知母皂苷BⅡ给药后的老龄组大鼠海马区神经元凋亡明显减少，海马区DA、NE及5-HT神经递质明显增加，动物行为学表现为从入水游泳到找到并且站立于水面下隐藏平台的时间明显缩短，即感知空间位置觉的能力和空间定位学习记忆能力明显改善。

综上所述，知母皂苷BⅡ可改善自然衰老大鼠学习和记忆行为，其作用机制与抑制神经损伤性炎性因子TNF-α和IL-6的表达、抑制大脑海马区神经细胞凋亡、保护神经细胞、改善神经系统微环境、存活神经元数量增加、神经元合成DA、NE及5-HT等神经递质增加有关。本实验中可能涉及到较为复杂信号通路如抑制神经细胞凋亡的信号通路和相关基因表达等，为下一步深入研究知母皂苷BⅡ分子药理学机制指明了方向。